広報活動

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2012年4月25日

独立行政法人 理化学研究所
国立大学法人 広島大学

10分以内にヒトの細胞1個の薬物分子を追跡

-新薬開発の高速化とオーダーメイド医療に新たな方向性-

ポイント

  • ヒトの肝臓細胞1個から薬物の副作用の原因にもなる分子変化を10分以内で分析
  • 従来法に比べて高速、高精度かつ低コストでの解析が可能
  • 薬物代謝の様子が細胞間で異なる“ゆらぎ”があることを発見

要旨

理化学研究所(野依良治理事長)は、生きた細胞の成分をリアルタイムかつ網羅的に検出できる「一細胞質量分析」を用いて、たった1個のヒトの肝臓初代培養細胞※1の薬物分子変化(薬物代謝)を10分以内で分析することに成功しました。また、同じ肝臓細胞でも代謝の様子が細胞間で異なる「ゆらぎ※2」があることも発見しました。これは、理研生命システム研究センター(柳田敏雄センター長)一細胞質量分析研究チームの升島努チームリーダー(広島大学 大学院医歯薬保健学研究院教授)と広島大学、参天製薬らとの共同研究グループの成果です。

肝臓は、薬物を異物として捉え、さまざまに分子変化させることで、体内に入った薬物を無毒化しようとする薬物代謝機能を持ちます。しかし、これが、かえって薬物を副作用の強い分子に変えることがあります。薬物代謝の様子を解析することは、薬効と副作用を確認するうえで新薬開発には欠かせません。ただ、この解析工程の最終段階ではヒトの組織を使わざるを得ないため、倫理上の問題や高コストをいかに解決するかが求められていました。

2008年に升島努チームリーダー(広島大学 大学院医歯薬保健学研究院教授)らは、1つの生きた細胞の変化を見ながら、その細胞内の分子群をリアルタイムかつ網羅的に検出する「一細胞質量分析」に初めて成功しました。従来の分析法では、多量の試料を必要とし、高いコストと手間がかかりましたが、一細胞質量分析では、細胞1個で生きた細胞の様子を見ながら解析でき、高速、高精度かつ低コストでの解析が可能です。今回、参天製薬の協力を得て、この分析手法を用いて緑内障の治療薬であるタフルプロストの薬物代謝をたった1個のヒト肝臓初代培養細胞を用いて10分以内で分析することに成功しました。また、さらに詳しく分析することで、同じ種類の細胞でもそれぞれに薬物代謝が異なる、いわゆる “ゆらぎ”があることも発見しました。このゆらぎは、生命現象を説明するうえで今後大きなカギを握る概念とされ、科学的にもまた医薬品開発においても考慮すべき生命現象の本質の1つと考えられています。さらに開発が進み、新薬候補分子がどの細胞にどう到達し、どう変化するかが詳細に分かるようになると、日本の製薬企業が希望する次世代創薬技術の確立が期待できます。本研究成果は、英国の科学雑誌『Nanomedicine』(5月号)に掲載されます。

背景

従来、細胞の働きや関係する分子を調べるときは、たくさんの細胞の集合体をすり潰し、これをさまざまな分析法で調べます。生体の応答は、1個の細胞の応答ではなく膨大な細胞の平均値なので、従来法でも間違いではないですが、生命現象の解明には問題があります。実際に1個の細胞を観察すると、同じ刺激に対しても個々の細胞の反応は多様で、それら異なる細胞の変化を正確に見ることが望まれていました。

特に、生きた細胞の変化を見ながら、その細胞内の分子変化をリアルタイムで追跡するのは、ライフサイエンスの夢でした。しかし、細胞の体積は1ピコリットル(1兆分の1リットル)と超微量で、観察している細胞1個の中で起こっている分子変化は検出不可能と思われていました。しかし、2008年に升島努チームリーダー(広島大学 大学院医歯薬保健学研究院教授)らは、1個の生きた細胞の変化を見ながら、その細胞内の分子群をリアルタイムかつ網羅的に検出する「一細胞質量分析」を開発しました。

この手法を医薬品開発や臨床試験に応用することができると、手に入り難いヒト細胞を用いても、数個の細胞で簡単に分析できるうえ、解析の高速化と低コスト化や分子情報の高精度化をもたらす新技術となることが期待できます。

研究グループは、創薬開発でもっとも重要な薬物代謝分析に一細胞質量分析が有効かどうか検証しました。まず、ヒト肝がん培養細胞HepG2を用いて、抗がん剤の一種であるタモキシフェンの薬物代謝の分析を試みました。その結果、1個の細胞から10分以内で細胞内分子を検出できました。(雑誌Analytical Science 2012年3月号に掲載されhot articleに選定)。

そこで、研究グループは、さらに生体に近い状態のヒト肝臓初代培養細胞の薬物代謝の一細胞質量分析に挑戦しました。

研究手法と成果

研究グループは、ヒト肝臓の初代培養細胞を対象に緑内障の治療薬であるタフルプロストの薬物代謝の分析を試みました。まず、顕微鏡下でターゲットの細胞の挙動を見ながら、見たい瞬間に先端口径が数μmのナノスプレーチップという金で被覆した細管で細胞内成分を吸い上げます。次に、チップの後方からイオン化有機溶媒※3を入れて、チップと質量分析計の間に1kV前後の高電圧をかけます。すると、イオン化有機溶媒が先端の細胞内成分を通り抜けながら、主に成分中の低分子を抽出し、分子群は霧と一緒に質量分析計に導かれます。ここまで5分以内で行うことができました。さらに検出された質量スペクトル中の1つ1つのピークは、特徴的な質量を持った分子を示し、このピークから細胞内成分の分子を網羅的に検出することができました。質量分析計で計測する時間は約5分で、合計10分以内で細胞内にある分子を検出できました(図1)

以前に行ったHepG2細胞の分析結果と比べると、同じ代謝物でもより高い代謝活性が確認でき、また多種類の薬物代謝物を発見しました。薬物代謝は、代謝経路と呼ばれる複数の反応の連鎖で行われます。各反応でできる中間代謝物を経て最終代謝物に至ります。この手法では、中間代謝物も含めて網羅的に定量できるので、代謝経路が追跡できます。さらに、タフルプロストを細胞培養液に添加し、その後の時間の経過とともに細胞内分子の質量スペクトルの違いを比べることで、時間的追跡もできることが分かりました。さらに今回の研究で細胞ごとに分析データが大きくばらつくことが分かりました。この実験結果について慎重に確認したところ、統計学的な誤差の範囲を上回る変動を検出しました。つまり、細胞ごとに薬物代謝が量的に異なる、いわゆる“ゆらぎ”があることを発見しました。従来、ゆらぎとは、分子スケールの時空間的変動を示したものですが、これが細胞の状態や機能で比較しても、変動が存在することを本研究で示すことができました。これは、生命現象の本質の1つであると示唆され、生命分子関連の学界において、これから活発な議論を呼ぶと考えられます。

今後の期待

1個の細胞で薬物代謝を追跡できるということは、高価で倫理的にも入手し難いヒト細胞を利用しやすくし、候補物質探索や代謝予測を高速、高精度かつ低コストで行うことを可能にします。それは、今後の創薬や臨床解析のスピードアップに貢献すると考えられます。

また、病理検査で行われる患者のわずかな病巣組織を細胞単位にして病態の進行度を分子診断することも可能になります。同時に数個単位の細胞から多様な薬物の代謝の様子を調べて、副作用の少ない最も適した薬物治療を提案するなど、さまざまな局面においてオーダーメイド医療と個別分子診断への新しい道を開くものと期待できます。今後、複数の製薬企業との連携を進め、この手法を用いた次世代創薬技術の確立を目指します。

原論文情報

  • Yasufumi Fukano, Naohiro Tsuyama, Hajime Mizuno, Sachiko Date, Mikihisa Takano, Tsutomu Masujima, “Drug metabolite heterogeneity between cultured single cells profiled by pico-trapping direct mass spectrometry” Nanomedicine, 2012 DOI:10.2217/NNM.12.34

発表者

理化学研究所
生命システム研究センター 細胞動態計測コア 一細胞質量分析研究チーム
チームリーダー
広島大学 大学院医歯薬保健学研究院 教授
升島 努(ますじま つとむ)

お問い合わせ先

生命システム研究センター
広報担当 川野 武弘(かわの たけひろ)
Tel: 070-6800-3938 / Fax: 06-6155-0112

報道担当

独立行政法人理化学研究所 広報室 報道担当
Tel:048-467-9272 / Fax:048-462-4715
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広島大学 学術・社会産学連携室 広報グループ
多賀 信政(たが のぶまさ)
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産業利用に関するお問い合わせ

理化学研究所 社会知創成事業 連携推進部
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補足説明

  1. 初代培養細胞
    生体から採取した組織や細胞を最初に播種して培養した細胞。特に生体内での細胞の性質が比較的保たれており、生体内と同様な挙動を示すことが期待されている。そのため、ヒトの初代培養細胞は、医薬品の効能や副作用のスクリーニングに多く用いられる。
  2. ゆらぎ
    「生命を担う分子は、室温あるいは生体の体温では、必ず熱運動に伴う振動や運動をしているが、それがある必然点を中心にその状態を変化させている状態をゆらぎという。生命は、このようなどこにもある熱エネルギーも巧みに使って、エネルギー効率の高い必然的な動きをしている」という概念。理研生命システム研究センター柳田センター長が世界に先駆けて提言した。従来は、分子スケールの時空間的変動を示したものであるが、本研究によって細胞の状態や機能で比較しても、変動が存在することを示すことができた。
  3. イオン化有機溶媒
    細胞1個に含まれる分子など極めて軽い分子の質量を測定する場合、どのような計測手法を用いるかが課題となる。質量分析では、電荷を背負わせた(イオン化)分子を真空の質量分析計内部に注入し、さまざまな電磁場との相互作用と分子の質量による強弱(重いとゆっくり電場に応答し、軽いと速く電場に応答する)を利用して測定する。具体的には分子にプラスの電荷を背負わせたい時は、ギ酸などの酸性(Hイオンが多く含まれる)分子と有機溶媒(アセトニトリルやメタノール)の混合溶媒を使用する。これをイオン化有機溶媒という。

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一細胞質量分析

図1 一細胞質量分析

①細胞内の任意の部位(細胞質、液泡や核の内部など)をナノスプレーチップで吸引する。
②吸い上げたチップの後部からイオン化有機溶媒を入れて、質量分析計の試料導入部の間に電圧をかけることで、微細な電荷を負った霧を発生させる。電荷が分子に乗り移りながら(イオン化)、質量分析計の中に導入される。
③分子の質量順に分子のピークが現れ、その高さは、量に比例する。

従来法では、たくさんの細胞をすり潰し、前処理、分離、質量分析という順に行われ数時間はかかっていたが、この手法を用いれば、細胞1個の補捉した局所に、どんな分子がどれくらい存在するかが操作時間10分程度という今まで想像できなかったスピードで解析できる。 予め薬物の分子構造が分かっているので、生体内で修飾を受けた代謝物も検出できる。その中には、副作用の強いものや、元の薬物より活性の高いもの等が存在し、それらの全容は新薬を開発する上で必須情報である。また臨床現場では、患者ごとの違いを把握して理想的な薬物治療を進める上で、必要不可欠な情報である。

細胞質から薬物や代謝物などの成分を吸い上げる様子

図2 細胞質から薬物や代謝物などの成分を吸い上げる様子

顕微鏡下でターゲットのヒト肝臓初代培養細細胞の挙動を見ながら、見たい瞬間にナノスプレーチップで細胞内成分を吸い上げる。

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