広報活動

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2013年6月20日

理化学研究所

“土に還る”バイオマスの分解・代謝評価法を構築

-環境・バイオマス試料の多角的な分析ツールによる統合的な解析に成功-

ポイント

  • 植物バイオマスの高次構造の違いが微生物の共代謝反応に与える影響を解明
  • 固体・溶液NMRなどによる環境・バイオマスの多角的な分析プラットフォームを整備
  • 微生物群集が介する環境や動植物の“ポジティブな”利用研究へ展開可

要旨

理化学研究所(野依良治理事長)は、環境・バイオマス試料の多角的な分析ツールを駆使して「土壌微生物生態系によるバイオマス分解・代謝評価法」を構築し、リグノセルロース[1]の複雑な立体構造(高次構造)の違いが、土壌微生物群の共生による「共代謝[2]反応」へ大きな影響を与えることを解明しました。これは、理研環境資源科学研究センターおよび社会知創成事業バイオマス工学研究プログラム(篠崎一雄センター長兼プログラムディレクター)環境代謝分析研究チームの菊地淳チームリーダーと、小倉立己大学院生リサーチアソシエイト、伊達康博特別研究員による研究成果です。

私たちの足元に広がる大地には多くの生物が生きており、それらが多種多様な物質を分解することで大地を豊かにしています。最も代表的な物質である植物バイオマスは、比較的分解されにくいリグノセルロースで形作られていますが、自然界では枯草や流木も分解され、最後には“土に還り”ます。この分解・代謝反応は微生物生態系[3]が担っており、地球上の物質循環に貢献しています。

研究チームは、稲わらのリグノセルロースを粉砕してその高次構造を変化させ、微生物反応場に与える影響について調べました。そのために①リグノセルロース構造や組成を解析する一次元および二次元固体核磁気共鳴(NMR)法[4]赤外分光(IR)法[5]の各種計測データ、②示差熱・熱重量測定(TG/DTA)法[6]により解析した熱分解特性データ、③溶液NMR法と濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)法[7]による微生物生態系の変動データを、本研究チームが開発した「ECOMICSツール[8]」で総合的に評価する「土壌微生物生態系によるバイオマス分解・代謝評価法」を構築しました。実際に解析した結果、バイオマスの持つ高次構造が、分解代謝の経路やそれに関わる微生物生態系に大きく影響を与えることが分かりました。

今回開発した評価技術は、廃棄物系バイオマス[9]処理を応用した生分解浄化システムなど、産業技術において応用可能です。また、土壌生態系における生物-生物間、生物-微生物間の相関関係と摂餌行動への影響、土壌-海洋間での栄養成分の循環系など、現在注目を集めている共生関係を基礎とした環境代謝分野の解析技術としても貢献できると期待できます。

本研究成果は、米国の科学雑誌『PLOS ONE』(6月19日付け:日本時間6月20日)に掲載されます。

背景

私たちが普段から目にしている樹木や草花は、春になると若葉や芽を出し、秋から冬にかけて葉を落としたり枯れたりし、土へと還っていきます。地面に落ちた葉は土壌中の生物群により分解され栄養となり、それを糧として次の春にはまた新たな芽をつけるというサイクルを繰り返しています。この循環システムの中において、土壌生物群による分解・代謝のメカニズムは地球上の物質循環という観点から非常に重要であり、植物分解に関する研究については数多くの報告があります。

植物は光合成を行うことで、水と二酸化炭素からグルコースを合成し、それを他の生物が利用する形で陸上の生態系が成り立っています。しかし土壌中においては、枯死した植物や動物の排泄物、死骸を分解する分解者を基盤とした生態系を形成しています。陸上と比べて空気が少ない土壌生態系では、さまざまな役割を持った生物・微生物が共生し、それぞれが共代謝という相互作用を起こして分解反応を行っています。しかし、解析の難しい難培養性微生物[10]が大半を占める土壌生態系の包括的な働きを調べた報告は少なく、土壌生態系による高分子複合体の分解メカニズムについての詳細は分かっていません。土壌科学では、こうした生物の多様性や、吸着・会合といった複雑な物理化学現象が絡んだ高分子複合体の解析技術の高度化が必要とされています。

また、リグノセルロースのような高分子複合体の分解過程は、多様な元素の循環にも関与しています。例えば、バイオマス分解後に土壌中に蓄積される腐植物質は金属元素を吸着する性質があり、雨などにより流出した腐植物質をデトリタス[11]食性の動物が摂取することで各種金属の生体濃縮も担っています。つまり、レアメタル濃縮のような喫緊の資源課題においても、このような環境中の物質代謝を理解し応用するヒントを与えてくれます。従来の環境分析は重金属や環境ホルモンなど、人間が懸念する“ネガティブな”物質のみに焦点を当てた報告がほとんどでしたが、今回は高分子混合物まで俯瞰的に解析することで、産業利用も視野に入れた自然の理を利用する“ポジティブな”展開を可能とするものです。

一方、豊かな里山生態系を育む水田環境は、山地からの栄養塩類や肥料の貯蓄に深く関わっており、多様な動植物の生息地帯となります。加えて水害の多いアジア・モンスーン地域では、1000年以上において持続的資源生産が可能な治水・食糧生産システムでもあります。世界三大穀物のうち、超長期的に毎年の連作を続けられる水田は、特徴的な土壌生態系を有し、特に灌水の有無で微生物生態系が大きく変化することが、その持続的生産性を左右していると考えられています。土壌微生物の生態や代謝機能を評価し、共代謝系における役割を理解することで物質生産や環境保持などの“ポジティブな”応用を可能とします。

本研究では、こういった土壌生態系を包括的に評価することのできる環境評価技術の構築を行いました。また構築した評価技術を用いて、植物バイオマスとして稲わら中のリグノセルロースの持つ高分子構造が分解微生物群に与える影響について評価しました(図1)。

研究手法と成果

研究チームはこれまで、生体由来の複雑な代謝産物を、未精製な混合物のまま溶液NMR法により一斉に計測・解析する手法を開発してきました注1)。今回、リグノセルロースのような難溶性の生体高分子解析のために、一次元および二次元-固体NMR法、IR法や TG/DTA法も併用し、これらの解析手法を組み合わせて構造的特徴の抽出を行えるようにしました。計測データは、数値マトリックス化することで、低分子代謝物の場合と同様の多変量解析[12]も利用できます。土壌中における微生物反応についても、代謝物・微生物群の変動を調べることで、バイオマス分解反応による土壌微生物生態系への影響や各代謝物と微生物の相関関係を解明することが可能となります。

実際の実験では、植物バイオマスとしての稲わらを粉砕してリグノセルロースの高次構造を変化させ、その高次構造や組成、熱力学的性質などを評価しました。さらに、構造状態の異なるバイオマスを水田土壌と混合し、土壌微生物生態系への影響についても併せて評価しました(図2)。

注1)2008年11月25日プレスリリース

(1)物理破砕によるリグノセルロース構造への影響

リグノセルロースの高次構造が壊れるくらい強い物理破砕処理を施して、異なる構造状態の稲わらを用意し、その高次構造の状態を一次元および二次元の固体NMR法、IR法、TG/DTA法などを用いて計測しました。各種計測データを、本研究チームが開発したECOMICSツールを用いて統合的に評価することで、従来の高分子分析法では得られなかった物理的・化学的特性の情報が得られるようになり、破砕処理条件の違いによる高次構造の違いを評価することが可能となりました。以上のような方法を用いて得られた我々の実験データでは、破砕強度が高いとリグノセルロースの結晶構造が非結晶構造に変化することが分かりました。また、リグノセルロースの構造が結晶から非結晶に変化すると、分解に必要なエネルギーが大きく低下することも明らかになりました。

(2)リグノセルロース構造の違いによる土壌微生物生態系への影響

リグノセルロースの構造の違いによる分解微生物群の活性への影響を溶液NMR法で、微生物生態系の変化をDGGE法で、それぞれ解析しました。溶液NMR法の結果から、構造の相異で分解代謝産物が異なり、各代謝物の産生量も大きく変化することが分かりました。またDGGE法の結果から、分解したバイオマス構造によってそれを利用する微生物群も大きく変化し、最終的にそれぞれ異なる微生物群集を形成すると分かりました。

以上から、リグノセルロースの持つ高次構造が、分解代謝の経路やそれに関わる微生物種などの微生物生態系に大きく影響を与えることが分かりました。今回、リグノセルロース系バイオマスの高次構造と微生物生態系の関係を評価できたことは、今後、土壌中で起こっている共代謝反応の科学的な理解や、農林業や地球科学に関する土壌評価[13]などへ応用できると期待されます。

今後の期待

今回開発した環境・バイオマスの多角的な分析ツールに基づく土壌微生物生態系によるバイオマス分解評価技術は、微生物生態系を応用した廃棄物処理プロセスなどの産業技術において、土壌やバイオマス評価に利用できます。また、共生微生物が関わるヒトや動物の恒常性評価の手法へも展開できると期待できます。2011年に研究チームらは、腸内微生物間でアミノ酸の受け渡しがあること注2)や、腸内微生物産生物の酢酸が病原菌を防ぐことを報告しました注3)。こうした共代謝反応の鍵となる物質として、従来は珍しい二次代謝物ばかりが注目されてきましたが、この報告ではアミノ酸や酢酸といったありふれた代謝物でした。これまでは、自然環境中の複雑な共生関係が絡み合う場合、鍵となる物質の絞り込みが困難でしたが、構築した評価法を用いれば容易に絞り込みができます。この新技術は、土壌の栄養・微生物状態と農作物の品質の関係性、土壌生態系における生物-生物間、生物-微生物間の相関関係と摂餌行動への影響、土壌-海洋間での栄養成分の循環系、土壌団粒構造の形成と栄養成分の貯蓄形態など(図3)、現在注目を集めている共生関係を基礎とした環境代謝分野の解析技術として大きく貢献すると期待できます。また、安定同位体標識技術[14]と組み合わせることで、NMR法の利点である部位特異的な解析ができることを利用した共代謝系における物質循環経路の追跡が可能となります。さらに、従来は低分子化合物の追跡・評価に限られていた共代謝系解析を、高分子化合物にも対応させることが可能です。このため、現在未解明な部分の多い動植物-微生物間、また微生物-微生物間の共生関係と各代謝産物の役割を解明し、森林-河川-海洋といった生命活動のサイクルを分子の観点から理解できると期待されます。

注2)2011年1月27日プレス発表
注3)同日プレス発表

原論文情報

  • Tatsuki Ogura, Yasuhiro Date, Jun Kikuchi "Differences in cellulosic supramolecular structure of compositionally similar rice straw affect biomass metabolism by paddy soil microbiota" PLOS ONE, 2013.

発表者

理化学研究所
環境資源科学研究センター 統合メタボロミクス研究グループ 環境代謝分析研究チーム
チームリーダー 菊地 淳 (きくち じゅん)

お問い合わせ先

環境資源科学研究推進室
Tel: 045-503-9471 / Fax: 045-503-9113

報道担当

理化学研究所 広報室 報道担当
Tel: 048-467-9272 / Fax: 048-462-4715
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産業利用に関するお問い合わせ

理化学研究所 社会知創成事業 連携推進部
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補足説明

  1. リグノセルロース
    セルロース、ヘミセルロース、リグニンといった高分子物質の複合体。複雑な高次構造を有し、植物細胞壁を構成する主な成分である。セルロース、ヘミセルロースの主な構成物質は糖であることから、石油などの枯渇資源を代替するバイオリファイナリーの原料源として注目されている。またリグニンは主にフェニルプロパノイドから構成されており、芳香環の付加価値からファインケミカルなどの工業的利用が期待されている。
  2. 共代謝
    微生物が増殖を行うために栄養源からエネルギーを取り出す作用を「資化」といい、エネルギーを取り出すと同時に増殖を行う。一方で、エネルギーを取り出さずに物質を分解したり、構造を変化したりして、他の微生物が利用可能な状態へと変化させる作用を「共代謝」と呼ぶ。環境中では複数の微生物が個々の分解能力を補完し、相互に作用を及ぼしながら分解・利用する微生物群集を形成、物質循環系を構築している。
  3. 微生物生態系
    複数の微生物が互いに関係性を持ちながら共存している生態系。動物のように捕食・被食の関係ではなく、さまざまな微生物が関係し、物質の代謝を行っている。生物の多様性維持機構や協力関係創出機構の解明を目的とする基礎的な研究から、複数の微生物を混合培養することによる有用物質の生産性向上を目的とする応用的な研究まで、広い範囲にわたって研究が行われている。
  4. 固体核磁気共鳴(NMR)法
    難溶性の固体物質、特に非晶状態かつ混合物のような複雑系にも適用可能な計測法。最も多く使われるCP-MAS法は、交差分極-マジック核回転法の略称である。固体状態の物質をNMRで計測した場合、線幅が広く、感度が不十分であるという問題があるが、この計測法を用いることで十分な感度を持った計測結果を得ることができる。これにより、固体状態での分子結合状態を解析することが可能となる。さらに二次元-固体HETCOR(異種核相関計測)法を用いると、固体状態の物質における1H-13Cのような異種核間の結合および運動性情報を得ることができる。
  5. 赤外分光(IR)法
    測定対象の物質に赤外線を照射し、透過(あるいは反射)光を分光することでスペクトルを得て、対象物の特性を知る方法のこと。赤外分光法は、気体から固体まで幅広い物性の試料を対象とすることができるため、物理化学の研究においてもよく使用されている。従来のリグノセルロース研究では、特にOH基やCOの結合状態といった焦点を絞った解析に利用されているが、スペクトル全領域を定量評価する試みが、高分子混合物を対象とする本研究のユニークさとなっている。
  6. 示差熱・熱重量測定(TG/DTA)法
    熱重量測定法とは、試料の温度を一定のプログラムに従って変化させ、その試料を加熱または冷却した時の試料の質量変化を連続的に測定する方法。脱水・分解・酸化・還元などの化学変化、昇華・蒸発・吸脱着など質量変化を伴う物理変化の検出に利用される。また示差熱分析とは、試料を加熱または冷却した際に起こる物理変化や化学変化に伴って試料内で発生する熱変化を、基準物質との温度差として検出する方法。リグノセルロース研究においては、構造や成分で熱分解特性が異なるため、各植物バイオマスの構造情報を抽出する手段の1つとなる。
  7. 濃度勾配ゲル電気泳動法(DGGE)法
    変性剤の濃度勾配があるゲルを用いて2本鎖DNAを電気泳動し微生物群集構造を解析する方法。ゲル中に変性剤の濃度勾配があると、2本鎖DNAは分子量の違いだけではなく、変性しやすさの違いによってもバンドの泳動パターンが異なるため、高い分離能が得られる。環境中の微生物群集は多種類を含み、その大部分が難培養性であるため、培養することなく多数の微生物を一斉に検出するための重要な手法の1つとなっている。
  8. ECOMICSツール
    環境サンプルから得られる大量のデータ(メタゲノムや酵素の配列データ、代謝物や高分子物質の構造および成分データ)を統合的に解析するために、本研究チームが開発したウェブツール。命名は、ECosystem trans-OMICSの大文字部に由来するが、EconomicsからNoを引いた造語でもある。その意図するところは、自然の摂理である環境調和をシステムとして捉え、研究活動の知的研鑚から経済成長一辺倒な近代社会の在り方を見直すというメッセージを込めている。
  9. 廃棄物系バイオマス
    バイオマスのうち、農林系残渣、水産系残渣、食品廃棄物、建設発生木材、廃紙、黒液(パルプ工場廃液)、下水汚泥といった人類の生産活動に由来する余剰物。黒液やチップ・製材工程からの廃材など廃棄物・副産物系バイオマス・エネルギーを熱需要に活用する形態を中心に導入が進展している。しかし、畜糞や食品廃棄物からメタンガスを回収する技術は確立されているものの、経済性の観点から相当量の廃棄物の確保が必要であり、回収方法などの問題から十分な普及には至っていない。
  10. 難培養性微生物
    地球上に存在している微生物のうち、単離培養が出来ないおよそ99%を占める微生物のこと。従来行われていた培養を用いた研究手法では解析することができないが、PCR法やDNAマイクロアレイ法、DGGE法など、単離が不要な手法を用いることで解析が行われている。
  11. デトリタス
    生物の遺骸やリグノセルロースといった有機物がある程度分解・会合を繰り返して形成され、粒子状の腐植物質になったもの。通常はその表面や内部に微生物群集が繁殖し、残っている多糖成分などを分解する。また、干潟などにいる貝やナマコといった底生生物の栄養となり、特に植物プランクトンが少ない中深海においてはデトリタス食性の動物プランクトン遺骸の沈降が貴重な栄養源であり、また地球全体の炭素貯留源としても重要である。
  12. 多変量解析
    複数の変数からなる多変量データを統計的に扱う手法。主成分分析、因子分析、クラスター分析などがある。大量のデータから主要因子を取り出すデータマイニングにおいてよく使われる解析法。今回の解析においては、破砕条件による高次構造の違いや、微生物分解、微生物群変動といった継時的変化を評価することに利用された。
  13. 土壌評価
    土壌中に生息している微生物の存在量やその種類、栄養源・水分の含有量によって土壌の持つ物質循環・浄化システムに与える影響評価のこと。土壌中に残存している農薬や有機物の生分解反応や森林-河川間の物質流動、土壌生物による有害元素の濃縮や土壌改善など、環境変動の影響を評価する際の1つの指標となる。また有害な物質や元素を分解したり体内に蓄積したりする有用微生物の発見にも役立つ。
  14. 安定同位体標識技術
    13C、 15N、 17Oといった原子核は天然存在比が低いものの、生体には安全な同位体核であるため、これら含んだ化合物を生物に取り込ませ、標識化して検出を容易にする方法のこと。NMR法では陽子数、原子番号とも偶数でない核(核スピンを有する核)が観測対象であり、安定同位体標識化が極めて有効となる。またNMR法により得られるスペクトルは分子内の検出核の位置情報を反映し、また分子内の位置情報は代謝中においても保存される性質を利用することで、部位特異的な同位体標識による代謝活性経路を調べることが可能となる。

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バイオマスの構造の違いによる発酵産物の図

図1 バイオマスの構造の違いによる発酵産物

化学組成は同一でも高次構造の異なるバイオマスの入力(左)が土壌微生物生態を変化させ(中央)、共代謝で得られる発酵産物が変化する(右)。

本研究で用いた手法の模式図

図2 本研究で用いた手法の模式

熾烈な生存競争が展開されている環境代謝分野と、ホットな分析トピックス図

図3 熾烈な生存競争が展開されている環境代謝分野と、ホットな分析トピックス

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