広報活動

Print

2013年7月16日

理化学研究所

マウス生殖細胞から特徴的なエピゲノム領域を発見

-従来不可能だった100個程度の細胞からのゲノム修飾解析技術を開発-

ポイント

  • 超微量解析技術により生殖細胞に特有な低メチル化DNA領域を発見
  • 生殖細胞に特有な遺伝子発現とエピゲノム関連の解析に有用なリソースを特定
  • 細胞分化や発がんに関するエピゲノム研究を促進

要旨

理化学研究所(理研、野依良治理事長)は、従来では不可能だった100個程度の細胞からのDNAメチル化[1]解析を可能とする技術を開発しました。この技術を用いてマウス胎児などから得られる少数の細胞を解析したところ、生殖細胞特有な遺伝子の発現に関わる低メチル化DNA領域を発見しました。これは、理研バイオリソースセンター(小幡裕一センター長)疾患ゲノム動態解析技術開発チームの阿部訓也チームリーダー、池田理恵子テクニカルスタッフ(筑波大学大学院博士課程在籍)、志浦寛相基礎科学特別研究員らと、米国アルバートアインシュタイン大学との共同研究グループによる成果です。

生物を構成する細胞は、次代に遺伝情報を伝える生殖細胞と体を構成する体細胞に大別され、それぞれで働く遺伝子も大きく異なります。一方、生殖細胞特有な遺伝子の一部が、がん化した体細胞(がん細胞)で発現することが知られていますが、なぜ生殖細胞とがん細胞で共通した遺伝子が発現するのかはいまだ不明です。

染色体を構成するDNAやタンパク質はさまざまな修飾を受けており、それぞれの細胞に特有な遺伝子発現はこの修飾パターン(エピゲノム[2])により起こります。遺伝子発現制御に重要なゲノム修飾の1つであるDNAメチル化の解析には従来大量の細胞が必要だったため、ごく少数しか得られないマウス胎児の生殖細胞などには適用できませんでした。

共同研究グループは、従来法を見直しさまざまな改良を加えることで100個程度のごく少数の細胞のDNAメチル化解析が可能な技術を開発しました。この技術を用いてマウス胎児などの生殖細胞を解析した結果、広範囲にわたって低メチル化状態にあるDNA領域を発見しました。この領域には、生殖細胞特有に発現する遺伝子が集中し、中には生殖細胞とがん細胞に共通して発現する「がん精巣抗原[3]」遺伝子群も含まれていました。これらの領域では、染色体を構成するタンパク質の修飾も特殊であり、極めて独特なエピゲノム状態にあることが分かりました。

がん精巣抗原遺伝子を含む広い領域が低メチル化状態にある、という今回の発見を手がかりとして、細胞の分化や、発がんに関与するエピゲノム研究が進展し、診断や創薬につながることが期待できます。また、今回開発した超微量解析技術は、応用範囲が広く、例えばこれまで解析困難だったiPS細胞集団に不均一性をもたらすエピゲノム状態の解析などへ展開し、より高品質のiPS細胞作製などへ適用できるでしょう。

本研究は、文部科学省特定領域研究「生殖系列の世代サイクルとエピゲノムネットワーク」などの支援を受け実施され、その成果は日本の科学雑誌『DNA Research』オンライン版(7月16 日付け:日本時間7月16 日)に掲載されます。

背景

生物を構成する細胞は、生殖細胞(精子、卵子など)と体細胞に大別されます。体細胞は身体を形づくるのに必要で個体一代限りの細胞ですが、生殖細胞は次代に遺伝情報を受け渡す重要な役割を持つ世代をつなぐ「不死」の細胞といえます(図1)。これらの細胞は異なる役割を持つため、そこで働く遺伝子も異なっており、生殖細胞だけで発現し機能する遺伝子が多数存在します。興味深いことに、例えば雄生殖細胞特有の遺伝子の一部は、正常な体細胞では発現しませんが、がん化した体細胞(がん細胞)で発現することがあります。これらの遺伝子は、「がん精巣抗原」遺伝子と呼ばれています。しかし、なぜ生殖細胞とがん細胞で共通して発現するのか、その意義やメカニズムは不明なままです。

細胞では、DNAのメチル化や染色体を構成するタンパク質であるヒストンのメチル化(ヒストン修飾[4])などさまざまな修飾が起きており、細胞ごとに固有の修飾パターンで、遺伝子の発現を制御しています。DNAメチル化は遺伝子発現に関わるため、その制御機構を理解する上で重要ですが、生殖細胞で起きるDNAメチル化についてはこれまであまり理解が進んでいませんでした。生体内で発生する生殖細胞の数が限られており、通常の手法では解析が困難なことや、生殖細胞と同様な性質を持つ適切なモデル細胞リソースが無いことなどがその理由に挙げられます。

研究手法と成果

共同研究グループは、生殖細胞に特有な遺伝子発現の制御機構とDNA修飾の関連性を調べることや、生殖細胞の特徴を兼ね備えた細胞リソースを探索することを目的に、網羅的な遺伝子発現解析とDNAメチル化の解析をマウスを用いて行いました。

マウスの生殖細胞は、受精後7.5日胚に初めて出現し、その後、体内を遊走して受精後11.5日前後に将来の精巣や卵巣となる胎児期生殖巣にたどり着きます。この生殖巣内で配偶子形成が進み、雌雄それぞれの生殖細胞、すなわち卵子と精子が作られます(図2)。胎児内に存在する生殖細胞の数はごく限られており、7.5日胚では50個程度、最も多い場合でも1つの胎児から得られる生殖細胞は数千個にすぎません。従来のDNAメチル化解析には十万~百万個ほどの細胞が必要なため、マウス胎児の生殖細胞には適用できません。そこで、共同研究グループは、従来法を見直し、偏りの少ないDNA増幅法など実験条件の最適化や、染色体全域が解析可能なカスタムマイクロアレイの利用などの改良を加えることで、最少100個程度の細胞から得られるDNA(総量が0.5ナノグラム以上)から染色体全体のDNAメチル化解析ができる技術を開発しました(図3)。

これを用いてマウス胎児から得られる生殖細胞、胚や生殖細胞に由来するさまざまな幹細胞、および数種の体細胞についてDNAメチル化を解析したところ、雄の生殖細胞から低メチル化状態にあるDNA配列を発見しました。そのDNA配列が染色体上のどこに存在するかを調べたところ、性染色体のX染色体に多く見られ、かつ比較的広い領域(最大9Mb=900万塩基長)に固まって存在していることが分かりました(図4)。X染色体上では、同様の特徴を持つ領域が全部で16カ所見つかり、これらを「Large Hypomethylated Domain(LoD)」と名付けました。一般に、マウスなど哺乳類のDNAはその大部分が高メチル化されており、その中に数Kb(数千塩基長)の小さな低メチル化領域「CpGアイランド」が点在することが知られていました。しかし、LoDのような広い領域にわたる低メチル化領域の発見は、今回が初めてです。

興味深いことに、LoDには生殖細胞特有に発現する遺伝子が集中して存在し、その中には「がん精巣抗原」遺伝子も複数含まれていました。通常、DNAの高メチル化は遺伝子発現を抑制するので、LoD領域に見られるDNAの低メチル化がこの領域の遺伝子発現を促進するのに必要であることが示されました。さらに、LoDの特徴として、DNAの低メチル化以外にヒストン修飾も特殊で、他の領域では見られない独特なエピゲノム状態にあることが分りました。この独特なエピゲノム状態が生殖細胞やがん細胞に特有な遺伝子発現の基盤になっていることが示唆されました。

次に研究グループは、LoD領域がマウスから作製した幹細胞株に存在するかどうかについて探索したところ、胚性幹細胞(ES細胞)、生殖細胞の元となる細胞から作製した胚性生殖細胞(EG細胞)にはLoDは存在しませんでした。しかし、京都大学大学院医学研究科の篠原隆司教授らが作製した生殖系列幹細胞(GS 細胞)[5]は、雄マウスの生殖細胞と類似した遺伝子発現パターンを示し、LoDを含め、ゲノム全体で非常によく似たDNAメチル化パターンも示しました(図5)。したがって、GS細胞は、生殖細胞特有な遺伝子発現とエピゲノムの関連を解析するための非常に有用な細胞リソースであることが明らかとなりました。

今後の期待

今回、100個程度の細胞からでも解析可能な技術を開発し、生殖細胞に特有なDNA領域のLoDを発見しました。今後LoDは、生殖細胞とがん細胞に共通のエピゲノムの形成や、がん細胞においてなぜ生殖細胞特有の遺伝子が発現するのか―などの意義について調べる手がかりになるだけでなく、生殖細胞やがん細胞のエピゲノムマーカーとしても利用が可能です。これらの解析には、理研バイオリソースセンターから提供されるGS細胞や各種がん細胞などのバイオリソースが大きく貢献するものと思われます。

今回開発した微量な試料でも解析可能なDNAメチル化解析技術は、これまで解析困難であった現象にも適用可能です。例えば、近年、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞の集団中には、分化状態の異なる細胞集団が混在することが示されていますが、こうした不均一性をもたらすエピゲノム状態の解析などへの展開が期待できます。

原論文情報

  • Rieko Ikeda, Hirosuke Shiura, Koji Numata, Michihiko Sugimoto, Masayo Kondo, Nathan Mise, Masako Suzuki, John M. Greally, Kuniya Abe. "Large, male germ cell-specific hypomethylated DNA domains with unique genomic and epigenomic features on the mouse X chromosome". DNA Research,2013,doi:10.1093/dnares/dst030

発表者

理化学研究所
バイオリソースセンター 疾患ゲノム動態解析技術開発チーム
チームリーダー 阿部 訓也 (あべ くにや)

お問い合わせ先

バイオリソース推進室
Tel: 029-836-9142 / Fax: 029-836-9100

報道担当

理化学研究所 広報室 報道担当
Tel: 048-467-9272 / Fax: 048-462-4715
お問い合わせフォーム

産業利用に関するお問い合わせ

理化学研究所 社会知創成事業 連携推進部
お問い合わせフォーム

このページのトップへ

補足説明

  1. DNAメチル化
    ゲノム(全遺伝情報)の実体であるDNAは、アデニン(A)・チミン(T)・グアニン(G)・シトシン(C)という4つの塩基からなるが、さらにこの塩基が化学的修飾を受ける場合がある。一般に、哺乳類のDNAでは、シトシン(C)の炭素原子にメチル基 (CH3)が付加される現象「メチル化」が知られている。このメチル化によりゲノムの構造や機能が変化し、遺伝子発現に影響を与える。DNAメチル化が関与する生命現象は、発生、細胞分化、ゲノム安定性維持や発がんなど多岐にわたる。
  2. エピゲノム
    染色体を構成するDNAやタンパク質は、メチル化、アセチル化などの後天的な化学修飾を受けている。この特定の細胞に固有なゲノム修飾状態全体を、エピゲノムと呼ぶ。
  3. がん精巣抗原
    がん精巣抗原は、がん細胞に特有の発現を示す腫瘍抗原の一種であり、正常な体細胞には存在しないが、精巣内の生殖細胞だけで発現する。がん精巣抗原はがん細胞の同定に有効であり、またがんの免疫治療の標的となる可能性も指摘されている。ヒトには260以上のがん精巣抗原遺伝子が存在し、その4割以上が性染色体であるX染色体にあることが知られている。
  4. ヒストン修飾
    DNAは、ヒストンというタンパク質に巻きついて「クロマチン」という構造を作り核内に収納される。そのクロマチンの構造が変わることで遺伝子のオン・オフが調節されるが、その構造変化はDNAメチル化だけではなく、ヒストンタンパク質にアセチル基やメチル基などが付く「ヒストン修飾」によっても制御されている。
  5. 生殖系列幹細胞(GS細胞)
    京都大学の篠原隆司博士らによって、新生雄マウスの精巣から作製された、精原細胞(精子幹細胞)に由来する幹細胞株のこと。長期間、試験管内で培養を続けることが可能であり、この細胞をマウス精巣に移植することで、GS細胞由来の精子を形成することができる。

このページのトップへ

図1 体細胞は一代限り、生殖細胞は「不死」

生物を構成する細胞は、生殖細胞(精子、卵子など)と体細胞に大別される。体細胞は身体を形づくるのに必要でその個体一代限りの細胞だが、生殖細胞は次代に遺伝情報を受け渡すという重要な役割を持ち、世代をつなぐ「不死」の細胞といえる。

マウス生殖細胞系譜と胚体、生殖細胞より作製される幹細胞の図

図2 マウス生殖細胞系譜と胚体、生殖細胞より作製される幹細胞

マウスでは、受精後3.5日目の胚は胚盤胞と呼ばれ、この胚からES細胞が作製される。その後子宮への着床を経て、受精後7.5日の胚で将来の生殖細胞の元となる始原生殖細胞が出現する。始原生殖細胞からはEG細胞と呼ばれるES細胞とよく似た多能性幹細胞が作製できる。始原生殖細胞は体内を遊走して将来の精巣や卵巣の元となる胎児生殖巣に到達し、その中で精子や卵子となる。GS細胞は、新生雄マウスの生殖細胞から作製される幹細胞株。

開発したDNAメチル化解析技術

図3 今回開発したDNAメチル化解析技術

(A)マウス胚、胎児からの生殖細胞の単離
生殖細胞で緑色蛍光タンパク質を発現する遺伝子導入マウスを材料に、蛍光発現を目印に生殖細胞を単離する。(上)胎児精巣内で緑色蛍光タンパク質を発現する生殖細胞、蛍光発現を指標に生殖細胞を単離(下)。

(B)微量細胞からのDNAメチル化解析
ゲノムDNAをメチル化感受性あるいはメチル化非感受性の制限酵素で切断し、それぞれのDNA断片をリンカーPCR法で偏りなく増幅させる。メチル化感受性酵素は、非メチル化DNAだけ切断しメチル化DNAは切断されず残るので、増幅されたものは非メチル化DNAに由来する。メチル化非感受性酵素は、メチル化の有無にかかわらず切断するので、ゲノム全体を含むDNA集団が得られる。それぞれを蛍光色素で標識し(例:非メチル=緑、ゲノム全体=ピンク)、ゲノムマイクロアレイと反応させる。低メチル化領域では、緑色蛍光の強度が相対的に高くなることからメチル化の程度を判断できる。

マウスX染色体上のLoD領域の同定図とLoD領域のDNAメチル化、ヒストン修飾、遺伝子発現パターンの模式図

図4 低メチル化DNA領域「LoD」

(A) マウスX染色体上のLoD領域の同定
体細胞と生殖細胞ゲノムのメチル化レベルを比較し、生殖細胞で低メチル化状態(体細胞の2分の1以下)にあるゲノム領域(LoD)を水色で示し、そこに含まれる遺伝子名を表示した。がん精巣抗原遺伝子群(Ssx、Fthl、Mageb、Magea) を含む領域を*で示した。LoDはマウスX染色体上には16カ所存在し、その平均サイズは約120万塩基対。
横軸はマウスX染色体を塩基対長で表してある(Mbp=100万塩基対長)。

(B) LoD領域のDNAメチル化、ヒストン修飾(H3K9ジメチル化)、遺伝子発現パターンの模式図
LoD領域(↔)には、生殖細胞で高発現を示す遺伝子群が集中しており、生殖細胞では低DNAメチル化状態、体細胞では高メチル化状態にある。ヒストンH3K9ジメチル化の修飾は、通常遺伝子発現に抑制的に働くと言われているが、生殖細胞、体細胞ともLoD領域に連続しており、LoDが独特なエピゲノム状態にあることが分かる。

生殖細胞、幹細胞株、体細胞組織のDNAメチル化パターンと細胞タイプの分類の図

図5 生殖細胞、幹細胞株、体細胞組織のDNAメチル化パターンと細胞タイプの分類

各種細胞サンプルのDNAメチル化パターンを解析し、その類似性を基に分類。胎児内の生殖細胞は、17.5日オス生殖細胞を除き、類似したメチル化パターンを持つ。多能性幹細胞であるES細胞、EG細胞も類似したメチル化パターンを示す。GS細胞のDNAメチル化パターンは新生雄マウスの生殖細胞(精原細胞)のパターンと非常に近いことが分かる。

このページのトップへ