広報活動

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2014年3月20日

理化学研究所

新しいDNA切断方法を開発

-簡単な操作でDNAの切断だけでなく連結も可能-

QBIC反応を応用したDNAの連結の図

QBIC反応を応用したDNAの連結

遺伝子工学は急速な進歩を遂げ、農作物の品種改良や、新しい薬品の創出など幅広い分野でDNAの組換えが用いられています。そのために必要となるのがDNAを切断し、連結する技術です。組換えDNAの作製には特定の塩基配列を認識して切断する酵素(制限酵素といいます)によってDNAを切断し、その切れ目をつなぐ酵素でDNAを連結する方法が用いられます。しかし、この方法では、制限酵素が認識する塩基配列が複数存在する場合に、切断したいDNAの部位以外も切断してしまうことがあるため、使用できる制限酵素が限られ、組換えDNAの設計が複雑化してしまいます。そこで、特定の塩基配列を必要としない「継ぎ目がないDNA」の連結方法も開発されています。その1つに、非天然型の塩基をDNA鎖合成の出発点となる分子(プライマー)として使い、DNAを増幅した後に、非天然型の塩基を導入した部位を切断する方法があります。ただ、この方法も、面倒な操作が必要なことや、非天然型の塩基が変異を引き起こしやすいことなどの欠点がありました。

理研の研究グループは、天然型の塩基「チミン」と似た構造の「5-エチルウラシル(EU)」に着目しました。EUを切断対象のDNA中に導入し、安価な試薬であるメチルアミン水溶液を加えたところ、EUを含むヌクレオチド部分でDNAの切断反応が起きていることを発見しました。研究グループはこの反応を「QBIC反応」と名付けました。この反応によって切断されたDNAを調べると、切断で生じた5′-末端にリン酸基がついていました。これは、切断で生じた断片をそのままDNAリガーゼ(切れ目をつなぐ酵素)で連結できることを示しています。次に、QBIC反応の応用として、ポリミラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅したDNAの連結を試みました。ヌクレオチドが複数連結されたオリゴヌクレオチドにEUを導入し、それらをプライマーとして増幅し、DNAの末端部分にEUを含むヌクレオチドを導入しました。増幅されたDNAでQBIC反応を起こすと、EUを含むヌクレオチド部分が切断されDNAの末端部分に切れ目が入りました。これにDNAを混ぜて加熱・冷却操作を行った結果、DNAが連結されました。また、これによって得られたDNAの配列決定の結果からDNAの複製時にEUが変異を起こしにくいことが分かりました。

今回の研究で、簡単な操作でDNAを切断・連結できることを明らかにしました。EUを含むヌクレオチドは多様な手段でDNAに導入可能なため、オリゴヌクレオチドやPCRなどで増幅したDNAだけでなく、プラスミドDNA、ゲノムDNAなど、さまざまなDNAを切断・連結する方法として、QBIC反応の利用拡大が期待できます。

理化学研究所
生命システム研究センター 細胞デザインコア 合成生物学研究グループ
グループディレクター 上田 泰己 (うえだ ひろき)