要旨

理化学研究所（理研）光量子工学研究領域画像情報処理研究チームの横田秀夫チームリーダー、竹本智子研究員と今本細胞核機能研究室の今本尚子主任研究員、三村恭弘特別研究員（研究当時）らの共同研究グループ^※は、細胞計測技術と画像情報処理技術を駆使し、大量の画像から核膜動態を定量解析するフレームワークを開発しました。

近年の生命科学分野では、客観的で信頼性の高い画像の自動定量解析法が、多くの場面で求められています。真核生物のゲノムを取り囲む核膜は、二層の脂質膜、核ラミナ、核内膜タンパク質群、核膜孔複合体（NPC）^[1]によって構築されています。細胞周期^[2]間期に、核膜は次の細胞分裂に備えて成長を続け、その過程でNPC数が倍加します。しかし、間期での核膜の成長過程、特にNPC形成にはまだ不明点が多く、その機構を調べるには、形成に関わる動態の定量的な評価が必要でした。

そこで共同研究グループは、核膜の特徴的なドメイン構造である「Pore-free island^[3]」が細胞周期の進行に伴って消失することに注目し、核膜動態の解明を目指しました。Pore-free islandのタイムラプス観察^[4]は困難だったため、離れた時間点での変化を膨大な画像データから自動解析する定量的画像解析フレームワークを確立しました。フレームワークは、観察から画像処理、数値定量化、シミュレーションまでの一連の処理から構成されています。その結果、Pore-free islandは新しいNPC形成が進むと消失していくことが明らかになりました。さらに、核膜上にはNPC形成のための“場”が存在する可能性が示されました。

本成果は、これまでのNPC形成機構の解明に関わる研究に全く新しい切り口を与えるものであり、今後の核膜孔研究に新たな方向性を示すものです。

本研究は、英国の科学雑誌『Scientific Reports』（11月24日付）に掲載されました。

※共同研究グループ

理化学研究所
光量子工学研究領域 画像情報処理研究チーム
チームリーダー 横田 秀夫（よこた ひでお）
研究員 竹本 智子（たけもと さとこ）
テクニカルスタッフ 西村 将臣（にしむら まさおみ）

今本細胞核機能研究室
主任研究員 今本 尚子（いまもと なおこ）
研究員 小川 泰（おがわ ゆたか）
特別研究員（研究当時） 三村 恭弘（みむら やすひろ）

大阪市立大学大学院 工学研究科化学生物学専攻
教授 立花 太郎（たちばな たろう）

背景

近年の生命科学分野では、画像情報処理技術に基づく画像計測と定量解析が定着しつつありますが、研究者の要求を満たす計測・解析技術の確立は容易ではありません。その理由の一つに、画像中の注目領域の検出が難しいことが挙げられます。手作業によって注目領域を検出する場合は、大量の画像の処理に膨大な時間と手間がかかる上に、得られた結果には人為的なバイアスが含まれる可能性があります。そのため、客観的で信頼性の高い画像の自動定量解析法が、多くの場面で求められています。

真核生物のゲノムを取り囲む核膜は、二層の脂質膜、核ラミナ、核内膜タンパク質群、核膜孔複合体（NPC）によって構築されています。NPCは核膜に大量に存在し、核と細胞質間の物質輸送を担っています。細胞周期間期に核膜は次の細胞分裂に備えて成長を続けますが、このときNPCは細胞周期の分裂終期と間期の2回、核膜上に形成されることが知られています。しかし、特に間期におけるNPC形成過程にはまだ不明点が多く、世界中の多くの研究者がさまざまな方法で解析を進めています。

また、NPCの不均一分布に起因した“NPCの存在しない領域”を「Pore-free island」と呼びます。Pore-free islandは間期初期に高頻度で観察され、細胞周期が進行するにつれて徐々に消失します（図1）。その形状は極めて多様性に富み、NPCの輝点の濃密さで定義するため、Pore-free islandには明確な境界が存在しません。そのため、従来の画像解析技術では検出することができませんでした。

そこで、共同研究グループは、理研内の異分野横断的プロジェクト「多階層をつなぐ４D細胞計測の次世代化による細胞動態の理解と操作」の枠組みのもと、生命科学と情報科学の融合により、大量の画像に対する定量的画像解析フレームワークを新たに提案し、Pore-free islandの消失とNPC形成過程の両者の関係を探る新しい切り口で、核膜動態の解明を試みました。

研究手法と成果

共同研究グループは、タイムラプス観察が難しい観察対象に対し、複数の時間点で取得した大量の観察画像から、観察対象の動態を客観的に理解するための定量的画像解析フレームワークを提案しました。ある離れた時間点での観察画像から対象の動態を解析するには、膨大な画像から得た計測データに基づく時間点間での比較が有用です。計測データとしては、観察対象のサイズ、個数、空間分布の3要素に注目しました。提案フレームワークでは、これらの要素獲得に、画像処理技術の一つである領域分割法を応用することで、恣意的なパラメータなどを一切排除した自動定量解析を実現しました（図2）。

NPCは、約30種類のタンパク質からなる大きなタンパク質複合体です。間期におけるNPC形成は、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）^[5]の活性に依存しています。まず、細胞をCDK阻害剤であるRoscovitine（ロスコヴィティン）と、対照の薬剤としてDNAポリメラーゼ^[6]阻害剤Aphidicolin（アフィディコリン）で処理した後に、完成したNPCを標識する抗体と、一つのNPC構成因子だけを標識する抗体で共染色した免疫染色画像を取得しました。

取得した画像を用いて、薬剤処理に対するPore-free islandの変化を、2点の離れた時間点で解析しました。提案フレームワークによって、Pore-free island領域の自動認識と、その内部に存在する多数の輝点の自動検出を実現しました（図3）。その結果、Pore-free islandのサイズ変化は、ロスコヴィティンで阻害されるNPC形成と相関すること、さらにPore-free island内の輝点がNPC前駆体であることが明らかになりました。

これらの結果は、Pore-free islandが細胞周期の進行に伴って消失するのは、NPC形成のためであることを示しています。つまりPore-free islandの消失は、その内部で新たなNPCが形成され、核膜上のNPCの不均一分布を解消しようとする働きによって制御されている可能性があります（図4）。

この結果に基づき、獲得したPore-free islandの形状情報と、その内部で検出されたNPC前駆体の個数情報を利用したシミュレーション実験を行いました。何の制約もないランダム条件下でPore-free island内にNPC前駆体を発生させた場合と、実際の観察結果を比較したところ、NPC前駆体が出現する空間的配置には、Pore-free islandの境界から遠ざかる位置に形成しようとする“場”が存在する可能性が示されました。

今後の期待

本研究では、大量画像の定量的解析フレームワークの構築によって、間期におけるNPC形成とPore-free islandの消失に関わりがあることを見いだしました。今回はNPCの構成因子のうち、一部のものを対象としましたが、解析対象をNPC全構成因子に広げることで、NPC形成の全容解明に迫れる可能性があります。

また、これまで核膜上のNPCの密度は、生物種や細胞種のよってさまざまであることが知られていましたが、それが何によって規定されているのか不明でした。本研究で発見したNPC形成の“場”の存在は、核膜上のNPCの密度によってその形成を制御する機構が存在する可能性を有しており、今後の核膜孔研究に新たな方向性を示すものです。

本研究で提案した画像解析フレームワークは、Pore-free islandの解析のためにオーダーメイドで考案したものです。しかし、フレームワークを支える個々の技術は、輝点分布の濃密による領域分割や、輝点の検出など、細胞内画像処理の多くの場面において汎用的に使用できるため、より多くの細胞画像の解析に役立つことが期待できます。

原論文情報

• Yasuhiro Mimura, Satoko Takemoto, Taro Tachibana, Ogawa Yutaka, Masaomi Nishimura, Hideo Yokota, Naoko Imamoto, "A statistical image analysis framework for pore-free islands derived from heterogeneity distribution of nuclear pore complex.", Scientific Reports, doi: 10.1038/s41598-017-16386-2

発表者

理化学研究所
光量子工学研究領域 エクストリームフォトニクス研究グループ 画像情報処理研究チーム
チームリーダー 横田 秀夫（よこた ひでお）
研究員 竹本 智子（たけもと さとこ）

主任研究員研究室 今本細胞核機能研究室
主任研究員 今本 尚子（いまもと なおこ）
特別研究員（研究当時） 三村 恭弘（みむら やすひろ）

報道担当

理化学研究所 広報室 報道担当
Tel: 048-467-9272 / Fax: 048-462-4715
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補足説明

• 1.核膜孔複合体（Nuclear pore complex, NPC）
  全ての真核細胞の核膜に存在する巨大なトンネル状のタンパク質複合体。核質と細胞質間をつなぎ、そのトンネルを通ってタンパク質などの分子が双方向に輸送される。
• 2.細胞周期
  細胞が分裂するサイクル。分裂期と間期に分けられ、さらに間期がG1期、Synthesis期（S期）、G2期に分けられる。分裂期は母細胞が二つの娘細胞に分裂する期間、間期は次の分裂期に備え、細胞が成長する期間。S期は特にDNA複製が行われる期間。
• 3.Pore-free island
  培養細胞において、細胞周期間期の初期に高頻度で観察される核膜上のサブドメイン領域。Pore-free islandはNPCを含まない領域として定義される。一方、NPCを高密度で含む領域をPore-rich regionと呼ぶ。これらの2領域はNPC以外の核膜構成因子の分布の違いでも観察されている。
• 4.タイムラプス観察
  ここでは生細胞のタイムラプス観察をさす。顕微鏡下で観察対象を生きたまま一定時間間隔で連続的に観察する方法。同一観察対象の動態を優れた時間解像度で観察することができる。
• 5.サイクリン依存性キナーゼ（CDK）
  細胞周期を進行させる原動力となるタンパク質リン酸化酵素。細胞周期を進行だけでなく、間期でのNPC形成の制御も担う。
• 6.DNAポリメラーゼ
  DNAを合成するための酵素。細胞周期の間期、特にS期においてDNAを複製し、次の細胞分裂のための準備を行う。