広報活動

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2017年5月12日

理化学研究所

核移植技術でアレルギーマウス誕生

-アレルギー疾患の原因解明と治療に期待-

要旨

理化学研究所(理研)バイオリソースセンター遺伝工学基盤技術室の小倉淳郎室長、井上貴美子専任研究員、神沼修客員研究員、佐伯真弓客員研究員、塩野義製薬株式会社創薬疾患研究所癌・免疫部門の形山和史免疫・炎症グループ長らの共同研究グループは、核移植クローン技術を用いて高感受性アレルギーモデルマウスを作り出すことに成功しました。

花粉や食物など特定の抗原に対するアレルギーは、多くの人の健康を脅かす病気です。生体に侵入したさまざまな抗原は、CD4陽性T細胞[1]と呼ばれるリンパ球の表面にある受容体(T細胞受容体[2]、TCR)に結合して、生体防御を目的としたさまざまな反応を引き起こします。アレルギー患者の体内では、この抗原反応性CD4陽性T細胞が増殖し、過剰な反応が起きるためにアレルギー症状が現れます。アレルギーが起こる原因の解明と予防・治療法の開発には、実験動物モデルが大きな役割を果たします。

今回、共同研究グループは、アレルギー誘発抗原として知られる、ダニ抗原や卵白抗原を注射したマウスから取り出した抗原反応性CD4陽性T細胞を用いて、核移植クローン[3]を行い、クローンマウスを作出しました。このCD4陽性T細胞のTCRは、アレルギー誘発抗原に反応するように遺伝子の再構成[4]を受けているため、クローンマウスの体内では、CD4陽性T細胞のほぼ全てが同じ抗原反応性TCRを持っています。つまり、クローンマウスの体内はあたかもアレルギー患者のように、抗原反応性CD4陽性T細胞が多く存在する状態になっています。共同研究グループが、生まれたクローンマウスを正常なマウスと交配すると、抗原反応性TCRの遺伝子が子孫に遺伝し、クローンマウス由来のマウス系統を樹立することができました。これらのマウスにダニ抗原や卵白抗原を投与したところ、1~2週間以内に、しかもわずか数回の投与で、気管支喘息やアレルギー性鼻炎に似た重篤なアレルギー症状が起こることが分かりました。

本研究で開発した高感受性アレルギーモデルマウス系統は、正常な繁殖能力を持ち、研究室で容易に飼育・維持できます。今後、アレルギーが起こる原因を解明したり、予防・治療法を開発するのに役立つと期待できます。

本研究成果は、欧州の科学雑誌『EMBO Reports』(5月2日付け)に掲載されました。

本研究は、日本学術振興会 科学研究費補助金 新学術領域研究「生殖細胞のエピゲノムダイナミクスとその制御」ならびに基盤研究「抗原特異的モノクローナルT細胞レセプターを介する免疫機構の解明」の支援および塩野義製薬(株)資金提供による共同研究(理研、東京都医学総合研究所、塩野義製薬)により行われました。

背景

花粉や食物など特定の抗原に対するアレルギーは、多くの人の健康を脅かす疾患であり、社会的にも大きな問題となっています。生体に侵入したさまざまな抗原は、抗原提示細胞[5]に取り込まれたのち、CD4陽性T細胞と呼ばれるリンパ球の表面にある受容体(T細胞受容体、TCR)に結合して、さまざまな反応を引き起こします。この反応は生体防御に必要ですが、CD4陽性T細胞が過剰に反応すると、抗原に対する反応も過剰になり、結果としてアレルギー症状を引き起こします。このようなアレルギーの発症機構を解明し、その予防・治療法を開発するためには、モデルとなる実験動物が欠かせません。しかし、アレルギー患者の体内で生じている特定の抗原反応性CD4陽性T細胞の増加状態を、実験動物の体内で再現することは困難でした。

これまでアレルギー症状を起こすマウスを作るには、マウスに数週間にわたって十数回以上も抗原を投与したり、あらかじめ体内に免疫応答を活性化する物質と共に抗原溶液を注射するなど、長期間の煩雑な作業が必要でした。最近では、抗原反応性TCRの遺伝子を導入したトランスジェニック(TCR-Tg)マウス[6]が開発され、抗原特異的なT細胞の反応を容易に誘発できるようになりましたが、そのTCRの発現は自然経過で発現したTCRとは異なり、人工的に挿入された遺伝子調節領域によって制御されているため、TCR-TgマウスのT細胞の反応が、生体が自然に獲得した抗原反応性T細胞の反応を正確に反映するか確証はありませんでした。

そこで共同研究グループは、核移植クローン技術に着目しました。核移植クローン技術を用いると、生まれてきたクローン動物は全身の細胞がドナー細胞と同じ遺伝子型を持ちます。このため、特定の抗原に反応するようTCR遺伝子が再構成されたCD4陽性T細胞に由来するクローン動物では、ほぼ全てのCD4陽性T細胞が、同じように再構成されたTCR遺伝子を保持します。これらのTCR遺伝子は、T細胞本来の調節領域による発現制御を受けるため、TCR-Tgマウスよりも自然に近い反応の観察が期待できます。

研究手法と成果

共同研究グループは、マウスにダニ抗原あるいは卵白抗原を注射して抗原に敏感な状態にし(抗原感作)、抗原に特異的に反応するT細胞のみが活性化されて増殖する性質を利用して、抗原感作マウスのリンパ節から取り出した細胞から目的のCD4陽性T細胞を増殖させました。しかし、核移植クローン実験には増殖していない静止期の細胞が必要なため、いったん増殖させた抗原反応性T細胞を静止期に誘導するよう工夫しました。

このようにして得られたCD4陽性T細胞を核ドナー細胞として核移植クローンを行った結果、これまでに18匹のクローンマウスが生まれ、そのうち11匹が成体に成長しました。これらのクローンマウスからT細胞を取り出して、ドナーT細胞の培養に用いた抗原と一緒に培養したところ、そのうち8匹のT細胞が抗原を認識して活性化されたことを確認しました。これらのマウスを正常マウスと交配すると、抗原反応性TCR遺伝子は子孫に伝達され、クローンマウス由来のマウス系統を樹立できました。

次にこれらのマウスに対し、ダニ抗原あるいは卵白抗原を投与しました。すると1~2週間以内に、しかもわずか数回の投与で、気管支喘息やアレルギー性鼻炎に似た重篤なアレルギー症状が起きました。ダニ抗原反応性CD4陽性T細胞由来のクローンマウス系統では、ダニ抗原の投与によって気管支肺胞領域に強い炎症が生じ、気道上皮の肥厚およびリンパ球や好酸球[7]の浸潤が観察されたほか、気道過敏性[8]の亢進がみられました。卵白抗原反応性CD4陽性T細胞由来のクローンマウス系統では、卵白抗原の投与によって鼻粘膜にリンパ球や好酸球が浸潤し、鼻粘膜過敏性[8]の亢進がみられました。

なお、TCRはα鎖とβ鎖が二量体を作ることによって初めて抗原反応性を示すとされていましたが、クローンマウス系統では、抗原反応性TCRα鎖またはβ鎖のどちらかだけを発現するマウスでも、アレルギー症状が強まることが分かりました。さらに、核移植に用いたT細胞に発現する抗原反応性TCRの違いによってT細胞の反応性やサイトカイン産生パターンが異なり、その結果引き起こされるアレルギー・免疫反応が異なることも分かりました(図1)。

今後の期待

本研究では、抗原特異的CD4陽性T細胞をドナー細胞に用いることにより、高感受性アレルギーモデルマウスの作出に成功しました。これらのマウスは、さまざまな免疫学的実験で使用される近交系[9]BALB/cマウスへ戻し交配[10]しています。また、今回はダニ抗原と卵白抗原を特異抗原に用いましたが、同様にスギ花粉など他の抗原でも特異的クローンマウスを作出できます。

本成果は今後、アレルギー疾患の発症機構を解明し、その予防・治療法の開発への貢献が期待できます。また、抗原特異的TCRα鎖およびTCRβ鎖を別々に発現する個体・細胞を得ることが可能になったことにより、TCRを介したT細胞の活性化や分化機構の解明にも大きく貢献できると考えられます。

※共同研究グループ

理化学研究所 バイオリソースセンター
遺伝工学基盤技術室
専任研究員 井上 貴美子 (いのうえ きみこ)
専任技師 越後貫 成美 (おごぬき なるみ)
特別研究員 (研究当時) 上村 悟氏 (かみむら さとし)(現山梨大学 日本学術振興会 特別研究員)
特別研究員 (研究当時) 及川 真実 (おいかわ まみ)(現ケンブリッジ大学 日本学術振興会 海外特別研究員)
室長 小倉 淳郎 (おぐら あつお)

山梨大学 総合分析実験センター
資源開発分野
准教授 神沼 修 (かみぬま おさむ)(理研バイオリソースセンター 遺伝工学基盤技術室 客員研究員)

東京都医学総合研究所 ゲノム医科学研究分野
花粉症プロジェクト
主席研究員 佐伯 真弓 (さえき まゆみ)(理研バイオリソースセンター 遺伝工学基盤技術室 客員研究員)
研究員 西村 友枝 (にしむら ともえ)
補佐研究員 北村 紀子 (きたむら のりこ)
プロジェクトリーダー 廣井 隆親 (ひろい たかちか)

塩野義製薬株式会社 創薬疾患研究所
形山 和史 (かたやま かずふみ)
東福寺 聡一 (とうふくじ そういち)
下茂 佑輔 (しも ゆうすけ)
石田 暁 (いしだ さとる)
七條 通孝 (しちじょう みちたか)(現: シオノギマーケティングソリューションズ(株)社長)

国立病院機構 相模原病院 臨床研究センター
先端技術開発研究部
部長 森 晶夫 (もり あきお)

川崎医科大学 呼吸器内科学
講師 加藤 茂樹 (かとう しげき)

原論文情報

  • Osamu Kaminuma, Kazufumi Katayama, Kimiko Inoue, Mayumi Saeki, Tomoe Nishimura, Noriko Kitamura, Yusuke Shimo, Soichi Tofukuji, Satoru Ishida, Narumi Ogonuki, Satoshi Kamimura, Mami Oikawa, Shigeki Katoh, Akio Mori, Michitaka Shichijo, Takachika Hiroi, Atsuo Ogura, "Hyper-reactive cloned mice generated by direct nuclear transfer of antigen-specific CD4+T cells", EMBO Reports, doi: 10.15252/embr.201643321

発表者

理化学研究所
バイオリソースセンター 遺伝工学基盤技術室
室長 小倉 淳郎 (おぐら あつお)
専任研究員 井上 貴美子 (いのうえ きみこ)
客員研究員 神沼 修 (かみぬま おさむ)
(山梨大学 総合分析実験センター 資源開発分野 准教授)
客員研究員 佐伯 真弓 (さえき まゆみ)
(東京都医学総合研究所 ゲノム医科学研究分野 花粉症プロジェクト 主席研究員)

塩野義製薬株式会社 創薬疾患研究所癌・免疫部門
免疫・炎症グループ長 形山 和史 (かたやま かずふみ)

報道担当

理化学研究所 広報室 報道担当
Tel: 048-467-9272 / Fax: 048-462-4715
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補足説明

  1. CD4陽性T細胞
    リンパ球の一種であるT細胞の中で、細胞表面にCD4と呼ばれる特徴的な分子を発現するもの。CD8を発現するCD8陽性T細胞が、ウイルス感染細胞やがん細胞を殺傷する役割を果たすのに対し、CD4陽性T細胞は外界から体内に侵入した抗原物質に反応して活性化し、生体防御を目的としたさまざまな免疫応答を引き起こす。
  2. T細胞受容体
    T細胞の細胞膜上に発現し、抗原物質を認識して細胞内に活性化刺激を伝える受容体。多くはα鎖とβ鎖の二量体から構成される。それぞれのTCR遺伝子が胸腺内でランダムに再構成されるため、個々の成熟T細胞に発現するTCRは多様性に富む。その結果、個体レベルではさまざまな抗原に対する免疫応答が可能となる。
  3. 核移植クローン
    染色体を除いた卵子にドナー細胞核を移植することにより、胚として発生させる技術。本研究のようにドナー細胞に体細胞を用いることで、体細胞クローン動物を作出できる。
  4. 遺伝子の再構成
    胸腺におけるT細胞発生の過程でTCR遺伝子に起きる不可逆的な編集現象。TCRα鎖およびβ鎖それぞれの遺伝子領域に存在するセグメント候補群(α鎖ではVαとJα遺伝子,β鎖ではVβとDβとJβ遺伝子)から、ランダムに各セグメントが選ばれて遺伝子が構成された後、各T細胞につき1〜2種類のTCRα、β鎖が転写、翻訳されて細胞表面に発現する。
  5. 抗原提示細胞
    抗原を細胞内に取り込み処理してT細胞に提示することで、T細胞を活性化させる機能を持つ細胞群で、樹状細胞やマクロファージなどが含まれる。抗原提示細胞に取り込まれた抗原は、アミノ酸数が10個程度の抗原ペプチドに分解され、自己MHC(主要組織適合遺伝子複合体)との複合体として細胞の表面に発現することで、T細胞が認識できるような形となり、T細胞に提示される。
  6. TCRトランスジェニクマウス(TCR-Tgマウス)
    再構成された抗原特異的TCRの遺伝子を、遺伝子操作によって人工的に導入したマウス。同じ抗原特異的TCRが、生体内のほぼ全てのT細胞に発現する。
  7. 好酸球
    白血球の中の顆粒球の一種。顆粒中に種々の細胞障害性タンパクを貯留しており、寄生虫感染時には脱顆粒によってそれらのタンパク質を放出し、生体を防御する役割を担う。アレルギー患者の患部にも多くの集積がみられ、障害性タンパクによる組織障害によって炎症の増悪や組織のリモデリングが引き起こされる。
  8. 気道過敏性、鼻粘膜過敏性
    気管支喘息患者では、発作時に気道が狭くなり呼吸困難症状が起きるが、気道局所に集積した好酸球などにより組織障害が起きた結果、誘発抗原だけでなく、さまざまな非特異的刺激に反応して気管支平滑筋が収縮しやすくなり、喘息発作を起こしやすくなる。この状態を気道過敏性の亢進という。アレルギー性鼻炎患者では、同様の現象が鼻粘膜でみられ、非特異的刺激に反応してくしゃみ、鼻漏などが起きやすくなる鼻粘膜過敏性の亢進が引き起こされる。
  9. 近交系
    兄妹交配を20世代以上継続して維持している系統。理論上、系統内の全ての個体は同じ遺伝子組成を持つ。
  10. 戻し交配
    親あるいは親と同じ系統・品種と交配すること。戻し交配を繰り返すことにより、遺伝的背景を均一化した子孫を得ることができる。

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抗原特異的CD4陽性T細胞の核移植によるクローンマウス作製の図

図1 抗原特異的CD4陽性T細胞の核移植によるクローンマウス作製

マウスにダニや卵白などの抗原を注射して、抗原に敏感な状態にする(抗原感作)。感作したマウスのリンパ節からCD4陽性T細胞を集め、抗原と一緒に短期間培養することで増殖させる(短期間の抗原刺激培養)。そのCD4陽性T細胞の核を、染色体を除いたマウスの卵子に移植する(核移植)。それを胚として発生させ、クローンマウスを作出する。生まれたクローンマウスは、核移植に用いたT細胞に発現する抗原反応性TCRの違いによって、引き起こされるアレルギー・免疫反応が異なる。

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