要旨

理化学研究所（理研）生命システム研究センター 一細胞遺伝子発現動態研究ユニットのデイビッド・プリエスト国際特別研究員、谷口雄一ユニットリーダー、集積バイオデバイス研究ユニットの田中信行研究員、田中陽ユニットリーダーの共同研究チーム^※は、大腸菌を1個ずつカプセル状やライン状の微細なくぼみに閉じ込めることで、遺伝子発現や細胞分裂速度など個々の大腸菌によって異なる性質を大量かつ高速にハイスループット解析することに成功しました。また、カプセル状、ライン状の微細構造体をそれぞれ「大腸菌カプセルホテル」「ラインホテル」と名付けました。

従来、細胞の性質を解析するには、細胞を集団として取り扱うことが基本でした。近年、細胞を1個ずつ解析することにより、遺伝子発現などの細胞の振る舞いが各細胞で異なり、細胞の個性ともいうべき性質があることが分かってきました。この単一細胞解析には、細胞を1個ずつ分離し解析する技術が不可欠です。これまで、シリコーンゴム製のマイクロ流体デバイスを利用するなどの手法が提案されていました^注1）が、デバイス作製に特別な機器や技術が必要でした。

今回、共同研究チームは、シリコーンゴムに代わる素材として、大腸菌培養で一般的に用いられる寒天に着目しました。遺伝子発現の解析では、大腸菌1個の大きさに相当する長さ4×幅0.6×深さ0.5マイクロメートル（μm、1,000分の1mm）のカプセル状のくぼみ「大腸菌カプセルホテル」を、寒天から精製したアガロース^[1]の表面1平方ミリメートルあたり65,000個作製し、大腸菌を1個ずつ閉じ込められるようにしました。また、細胞分裂速度の解析では、長さ300×幅0.85×深さ0.5μmのライン状のくぼみ「ラインホテル」を作ることで、分裂した大腸菌がそれらの中で増殖できるようにしました。このような微細な構造体は、それぞれの構造体に対応する鋳型に溶かしたアロガースを流し込むことで容易に作製できるように工夫しました。一度、鋳型を入手すれば、微細加工用の特別な機器や技術がなくても、研究室で微細構造体を何度でも作製することができます。実際に、開発したデバイスを利用して、大腸菌の増殖を1細胞ずつ個別に測定することに成功しました。

本成果を顕微鏡観察技術と組み合わせることで、大腸菌だけでなく、微生物生理学、バイオテクノロジー、多剤耐性菌解析など幅広い分野を対象としたハイスループット解析の実現が期待できます。

本研究成果は、英国のオンライン科学雑誌『Scientific Reports』（12月21日付け：日本時間12月21日）に掲載されます。

注1）Taniguchi, Y, Choi, P. J., Li, G., Chen, H., Babu, M., et al. "Quantifying E-coli Proteome and Transcriptome with Single-Molecule Sensitivity in Single Cells" Science 329, 533-538 (2010)

背景

従来、細胞の性質を解析するには、細胞を集団として取り扱うことが基本でした。近年、細胞を1個ずつ解析することにより、遺伝子発現などの細胞の振る舞いが各細胞で異なり、細胞の個性ともいうべき性質があることが分かってきました。このような単一細胞解析には、細胞を1個ずつ分離し解析する技術が不可欠です。

少数の細胞を顕微鏡で観察することは比較的容易です。しかし、数千個の細胞の高画質な画像を、数百種類の細胞種ごとに撮影するのは極めて困難です。一方で、このような大量の顕微鏡画像といった「ビッグデータ」は、現在の細胞生物学の中で重要性を増しています。例えば、細胞集団ごとの遺伝子発現量といった性質のばらつきや、1,000個の細胞に１個の割合で起こるような極めて珍しい細胞の振る舞いを捉えようとする際には、このようなビッグデータが不可欠です。

2010年、谷口ユニットリーダーらはシリコーンゴムに96個のマイクロ流路を作り込み、それぞれの流路に異なる細菌サンプルを導入できるデバイスを開発しました。この研究は、細菌のハイスループット画像解析の端緒となりましたが、デバイス作製のために高い技術が必要でした。

研究手法と成果

共同研究チームはまず、より改良した手法として、接着作用のある分子を用いて微小な細菌を顕微鏡観察用のカバーガラス表面に留めることを考えました。しかし実際に細菌を付着させてみると、カバーガラス表面に留めることはできましたが、今度は多くの細胞が集まってしまい、個々の細胞として顕微鏡で見ることはできませんでした。

そこで、シリコーンゴムに代わる素材として、大腸菌培養で一般的に用いられる寒天に着目しました。寒天から精製されるアガロースの表面に微細なくぼみを彫り込めば、大腸菌をくぼみにうまく閉じ込められるのではないかと考えました。半導体製造にも利用される電子線描画装置^[2]と呼ばれる、1マイクロメートル（μm、1,000分の1mm）以下の細かなパターンを描画できる装置を使って、シリコンウエハ表面に塗布されたフォトレジストと呼ばれる保護膜に大腸菌1個が入るカプセル状のパターンを描画しました。

次に、この表面をプラズマ^[3]で削ることで、保護膜がないところだけくぼみができるようにしました。このくぼみが付いたシリコンウエハが最初の鋳型になります。この鋳型からまず、シリコーンゴム表面に表面形状を転写します。さらに転写されたシリコーンゴムからアガロースへと形状を転写することで、アガロース表面に元のシリコンウエハの鋳型の表面形状を作ることができました。共同研究チームは、このアガロース表面のくぼみを「大腸菌カプセルホテル」と名付けました。

この大腸菌カプセルホテルに大腸菌を含む液体を流し、大腸菌をくぼみに自然に取り込ませることにも成功しました。くぼみの大きさは長さ4×幅0.6×深さ0.5マイクロメートル（μm、1μmは1,000分の1mm）で、標準的な大腸菌1個が入る大きさです。このくぼみが、１平方ミリメートルあたり65,000個の密度で整然と並んでいます。大腸菌を取り込ませた後に、顕微鏡で観察すると、大腸菌が整列している様子がよく分かり、遺伝子発現の解析ができました（図1）。

いかに自動処理に適した良好なデータが得られるかが、ビッグデータ解析の鍵ですが、本研究では個々の大腸菌と位置を対応付けられることで、シンプルな手順で画像を自動的に解析することができました。

また、この大腸菌カプセルホテルによる細胞整列法を、細胞分裂速度の解析に応用しました。この場合、アガロース表面に長さ300×幅0.85×深さ0.5μmのライン状のくぼみを作製し、「ラインホテル」と名付けました。まず、このくぼみに大腸菌が１個だけ入るように、薄い濃度で付着させます。その後、培養を行うと大腸菌は細胞分裂を繰り返しますが、くぼみの外側に外れることなく、くぼみに沿って一列に増殖する様子が観察されました。単位時間あたりに伸びる1列の長さから、細胞増殖速度を測ることに成功しました。

今後の期待

本研究では、細胞をうまく整列させた状態で顕微鏡観察することにより、遺伝子発現や細胞分裂速度といった生物学的特徴を、大量の試料から単一細胞レベルで高速かつ簡便にハイスループット解析することに成功しました。この手法は例えば、細胞へのウイルス感染の様子の観察や腸内細菌群に含まれる希少な細菌の解析に応用できると考えられます。

また、一般的な微細加工では、非常に脆く壊れやすいシリコンウエハを使いますが、本研究では、大腸菌カプセルホテルとラインホテルの鋳型をシリコーンゴムに転写しておくことで、この問題を解決しています。シリコーンゴムの鋳型を入手すれば、研究室で多用されているアガロース使って、微細構造体を簡単に、何度でも製作することができます。このため、本研究成果と顕微鏡観察技術とを組み合わせることで、微生物生理学、バイオテクノロジー、多剤耐性菌解析など幅広い分野を対象としたハイスループット解析の実現が期待できます。

原論文情報

• David G. Priest, Nobuyuki Tanaka, Yo Tanaka, and Yuichi Taniguchi, "Micro-patterned agarose gel devices for single-cell high-throughput microscopy of E. coli cells", Scientific Reports, doi: 10.1038/s41598-017-17544-2

発表者

理化学研究所
生命システム研究センター 細胞動態計測コア 細胞動態計測研究グループ 一細胞遺伝子発現動態研究ユニット
国際特別研究員 デイビッド・プリエスト（David Priest）
ユニットリーダー 谷口 雄一（たにぐち ゆういち）

生命システム研究センター 細胞デザインコア 合成生物学研究グループ 集積バイオデバイス研究ユニット
研究員 田中 信行（たなか のぶゆき）
ユニットリーダー 田中 陽（たなか よう）

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補足説明

• 1.アガロース
  海藻から作られる寒天を精製したもので、生物学実験では、核酸電気泳動や大腸菌培養などに利用され、生物学分野の研究室ではなじみ深い物質である。
• 2.電子線描画装置
  直径数ナノメートル（nm、1nmは10億分の1m）にまで絞り込んだ電子線を平面上に移動させることによって、電子線によるパターンを描画できる装置。電子線が照射されると溶けやすくなる電子線レジストと組み合わせて、微細な電子線レジストのパターンをシリコンウエハ上に付与し、その後エッチングを行うことでシリコンウエハ上に微小構造体を作製できる。
• 3.プラズマ
  電離した物質の陽イオンと電子とが混在している状態。特にここでは、六フッ化硫黄のプラズマを利用している。このプラズマをシリコンウエハに衝突させることにより、シリコンウエハ表面を衝突方向にのみ深く削るエッチングを行うことができる。