理化学研究所（理研）脳神経科学研究センター システム分子行動学研究チームの増田 美和 テクニカルスタッフⅠ（研究当時）、吉原 良浩 チームリーダー、東京大学大学院 農学生命科学研究科の伊原 さよ子 助教、東原 和成 教授らの共同研究チームは、傷ついた魚の皮膚から放出され、周囲にいる仲間の魚に危険を知らせる嗅覚警報物質^[1]を発見しました。

本研究成果は、動物が危険を回避する神経メカニズムや社会コミュニケーションにおける嗅覚の役割の理解、さらには化学物質による魚の行動制御技術の開発に貢献すると期待できます。

1938年、動物行動学者カール・フォン・フリッシュ（Karl von Frisch）^[2]（1973年ノーベル生理学医学賞）は、傷ついた魚の皮膚から放出され、周囲にいる同種の魚に危険を知らせる嗅覚警報物質の存在を提唱しました。今回、共同研究チームは、ゼブラフィッシュ^[3]の皮膚抽出物に存在する二つの化合物（オスタリオプテリン、硫酸化ダニオール）を同定し、ゼブラフィッシュはこれら二つの物質を同時に嗅ぐことによって危険を察知し、逃避・フリーズなどの忌避行動を現すことを見いだしました。

本研究は、科学雑誌『Current Biology』オンライン版（2月28日付：日本時間2月29日）に掲載されました。

背景

嗅覚系は、物体から発せられる匂い分子や、同種の他個体から分泌されるフェロモン^[4]分子を受容し、その情報を鼻から脳へと伝え、特有の行動や内分泌系・自律神経系の変化を引き起こす神経システムです。とりわけ、①危険な匂いからの逃避反応、②食物の匂いへの誘引反応、③性フェロモンを介した性行動は、多くの生物に共通する三つの根源的な嗅覚行動です。

カール・フォン・フリッシュ（Karl von Frisch）は1938年、傷ついた魚の皮膚から水中に放出される何らかの物質が警報シグナルとして機能し、近くにいる仲間の魚に危険な状況を知らせて、忌避行動を引き起こす現象を発表しました。その後、多くの研究者たちが魚の忌避行動を指標にして警報物質の精製・同定に挑戦してきましたが、その実体解明には至っていませんでした。

そこで共同研究チームは、モデル生物として確立されたゼブラフィッシュを用い、嗅覚警報物質が忌避行動を引き起こすときに活性化される嗅覚受容体^[5]と嗅覚神経回路に着目し、行動学・分子生物学・生化学・神経解剖学・神経活動イメージングなどの実験手法を組み合わせた統合的な研究戦略を用いて警報物質の精製・同定を試みました。

研究手法と成果

共同研究チームはまず、ゼブラフィッシュの嗅覚忌避行動を詳細に解析しました。ゼブラフィッシュの皮膚抽出物を調製し、別のゼブラフィッシュが泳いでいる水槽に投与したところ、高速遊泳（Darting）・フリーズ（Freezing）・水底での滞在（Bottom dwelling）という特徴的な行動が観察されました（図1）。一方、嗅上皮（きゅうじょうひ）^[6]を除去したゼブラフィッシュではこれらの行動はまったく観察されませんでした。すなわち、皮膚抽出物中に含まれている何らかの警報物質をゼブラフィッシュが嗅覚系で感知することで、強い忌避行動が引き起こされることを確認しました。

次に、皮膚抽出物によって活性化される嗅覚神経回路の解析を行いました。鼻腔の嗅細胞で受容された匂い情報は、嗅覚系の一次中枢である嗅球（きゅうきゅう）^[7]という脳領域内の特定の糸球体（しきゅうたい）^[8]へと伝えられ、匂い分子の構造をもとにした「匂い地図」として嗅球上に表現されます。その後、終脳（大脳皮質・海馬・扁桃体などを含む最も吻側の脳領域）や間脳（視床と視床下部）の高次嗅覚中枢へと情報はさらに伝達され、多様な嗅覚行動の発現へと至ります。

そこで、皮膚抽出物によって活性化される糸球体の同定を試みました。神経活動マーカーである抗リン酸化ERK抗体を用いた免疫染色^[9]によって、ゼブラフィッシュ皮膚抽出物は背側（はいそく）糸球体前方部（dGa）・外側（がいそく）糸球体4（lG4）・腹側（ふくそく）後方糸球体2（vpG2）という三つの糸球体を活性化することが分かりました（図2）。

また、共同研究チームは、キンギョあるいはメダカからも皮膚抽出物を調製し、ゼブラフィッシュが泳ぐ水槽に投与して、その行動の変化と糸球体の活性化を調べました。ゼブラフィッシュは、キンギョ皮膚抽出物によって中程度の忌避行動を、メダカ皮膚抽出物によって非常に弱い忌避行動を示しました。キンギョ皮膚抽出物はlG4とvpG2糸球体を、メダカ皮膚抽出物はvpG2糸球体だけを活性化しました（図2）。以上の結果から、強い忌避行動を引き起こすにはdGaとlG4糸球体の活性化が必要であることが分かりました。

そこで、ゼブラフィッシュ皮膚抽出物に含まれるdGa活性化物質とlG4活性化物質の生化学的精製と構造決定を、各種クロマトグラフィー^[10]と質量分析^[11]技術を駆使して行いました。その結果、dGa活性化物質は新規の硫酸化胆汁アルコール^[12]、lG4活性化物質はこれまで機能が分かっていなかったプテリン^[13]誘導体であることが明らかとなりました（図3）。

さまざまな魚種でこの2種類の化合物の存在を調べたところ、dGa活性化物質はゼブラフィッシュ（Danio rerio）とパール・ダニオ（Danio albolineatus）という魚種特異的な硫酸化胆汁アルコールであったので、硫酸化ダニオール（Daniol sulfate）と命名しました。一方、lG4活性化物質はゼブラフィッシュとともにキンギョ・コイ・ドジョウ・ナマズなど淡水魚の約70％を構成する骨鰾上目（こっぴょうじょうもく）^[14]（Ostariophysi）に共通に存在するプテリン誘導体であったので、オスタリオプテリン（Ostariopterin）と名付けました（図3）。なお、棘鰭上目（きょくきじょうもく）^[15]に属するメダカは硫酸化ダニオールもオスタリオプテリンも持っておらず、dGaとlG4糸球体がメダカ皮膚抽出物によっては活性化されなかった理由が明らかとなりました。

最後に、硫酸化ダニオールとオスタリオプテリンを有機合成し、それらのゼブラフィッシュの行動への影響を観察しました。硫酸化ダニオール単独では、ゼブラフィッシュの行動に変化はほとんどありませんでした。一方、オスタリオプテリンは高濃度において、弱いながらも有意な忌避行動を引き起こしました。さらに、二つの物質の混合物を水槽に投与すると、ゼブラフィッシュは強い忌避行動を示しました（図4）。

以上の結果から、嗅覚警報反応を引き起こすためには、傷ついた魚から発せられる硫酸化ダニオールとオスタリオプテリンがdGaとlG4の糸球体を同時に活性化することが重要であることが分かりました。また、オスタリオプテリンは「危険を知らせるシグナル」、硫酸化ダニオールは「仲間の存在を知らせるシグナル」であり、これら二つの情報が合わさることにより、ゼブラフィッシュは仲間が危険な状況にあることを感知できると考えられます。

今後の期待

私たち人間がガス漏れの匂いで危険を感知するように、多くの生物は嗅覚を用いて自分の周囲に存在する危険をすばやく察知し、逃避・フリーズなどの適切な行動を起こします。今回の研究により、警報匂い分子の入力から忌避行動の出力へと至るゼブラフィッシュの神経機構が解明されました。この成果は魚類のみならず、脊椎動物に共通な嗅覚忌避行動や社会コミュニケーションにおける嗅覚の役割の全体像解明につながると期待されます。

また本研究では、多くの淡水魚に共通に存在する警報シグナルの「オスタリオプテリン」とゼブラフィッシュが仲間であることを知らせる「硫酸化ダニオール」の両方が存在するときにだけ、ゼブラフィッシュは強い忌避行動を現すことが分かりました。このような警報物質と魚種特異的フェロモンを組み合わせて利用することで、特定の魚種の行動を制御する技術が可能となるでしょう。例えば漁業や外来魚駆除などに応用できれば、自然環境と生態系の保護を目指した、さらなる研究への展開が期待されます。

補足説明

• 1.嗅覚警報物質
  生物に危険を知らせる匂い物質。これまでにアリ・ミツバチ・ラットなどにおいて同種の個体同士で危険情報を知らせる警報フェロモンについての報告がなされている。また、ネコの匂いをネズミが忌避するような異種間で認識される警報物質はカイロモンと呼ばれる。私たち人間は、ガス漏れを迅速に察知するために、無臭の都市ガスにあえて匂いを付けて嗅覚警報物質とすることで利用している。
• 2.カール・フォン・フリッシュ（Karl von Frisch）
  オーストリアの動物行動学者（1886～1982）。ミツバチがダンス行動により複雑なコミュニケーションをすることや、魚類の嗅覚警報反応を発見し、動物行動学という学問分野の礎を築いた。1973年、ニコ・ティンバーゲン、コンラート・ローレンツとともにノーベル生理学・医学賞を受賞した。
• 3.ゼブラフィッシュ
  インド原産の体長3～5cmの小型熱帯魚。飼育が容易で多産。稚魚の体は透明なので、体内の発達過程を生きたままで観察することができる。発生工学的手法を用いて、特定の神経細胞を可視化したり、特定の遺伝子の機能を阻害したりすることができる。魚類と哺乳類の脳の基本構造は同じなので、脳研究のモデル生物として利用されている。
• 4.フェロモン
  動物の体内で作られ、体外に放出されて、同種の他個体の行動や内分泌系、自律神経系に影響を与える化学物質（生理活性物質）の総称。性フェロモン、警報フェロモン、集合フェロモン、道標フェロモンなどが知られている。
• 5.嗅覚受容体
  鼻腔に入ってくる匂い分子やフェロモン分子を認識する受容体。鼻の奥に存在する嗅細胞に発現している。多種多様な匂い分子・フェロモン分子に対応できるように、ヒトでは約400種類、マウスでは約1,400種類、ゼブラフィッシュでは約300種類の嗅覚受容体遺伝子がゲノムに存在している。
• 6.嗅上皮（きゅうじょうひ）
  鼻腔の奥にある上皮組織。鼻腔に入ってくる匂い分子・フェロモン分子を感知する嗅細胞が並んでいる。
• 7.嗅球（きゅうきゅう）
  嗅覚神経系の一次中枢として機能する脳の領域。匂いを受容する嗅細胞の神経線維が直接接続している。
• 8.糸球体（しきゅうたい）
  嗅球の表面に並んだ神経線維から成る球状の構造体。一つの糸球体は同じ嗅覚受容体を発現する嗅細胞に神経支配されており、その嗅覚受容体と結合する匂い分子の情報を表現している。嗅細胞（一次嗅覚ニューロン）で受容された匂い分子の情報が、糸球体内のシナプスを介して嗅球ニューロン（二次嗅覚ニューロン）へと伝達される。
• 9.免疫染色
  抗体を用いて組織や細胞などのサンプル中における抗原（タンパク質など）を検出する実験方法。検出したいタンパク質に対する特異的な抗体を用いることで、興味のあるタンパク質についてサンプル中のどこにどのくらいの量が存在するのかを知ることができる。
• 10.クロマトグラフィー
  カラムと呼ばれる管の中に保持された固定相と物質の相互作用によって混合物から物質を分離・精製する実験方法。物質の大きさ・電荷・疎水性・吸着力などの違いを利用して、物質を成分ごとに分離することができる。
• 11.質量分析
  原子または分子をイオン化し、それらを高真空中で加速、電場や磁場の中を移動させて、各イオン種の質量による場との相互作用の違いを利用して、分離・検出する分析手法。観測される質量スペクトルから、化合物の分子量・分子式・化学構造に関する情報を得ることができる。
• 12.胆汁アルコール
  脊椎動物の胆汁に含まれる有機アルコールの総称。肝臓でコレステロールから合成され、胆のうで蓄えられ、十二指腸や血中に分泌されるステロイド化合物。
• 13.プテリン
  ピラジン環とピリミジン環から構成される有機化合物の総称。生物界に広く存在し、蝶の羽の色素、酵素の触媒作用における補因子としての機能などが知られている。魚では皮膚の黄色色素細胞に含まれており、オスタリオプテリンはこの色素細胞で合成・貯蓄されると考えられる。
• 14.骨鰾上目（こっぴょうじょうもく）
  魚類では2番目に大きな上目であり、現生魚類の28％に当たる約8,000の魚種を包含し、淡水魚の約70％を占める。ゼブラフィッシュの他に、コイ・ナマズ・キンギョ・ドジョウ・テトラなどもこの上目に含まれる。骨鰾上目に属する多くの魚種が嗅覚警報反応を起こすことが報告されている。
• 15.棘鰭上目（きょくきじょうもく）
  魚類で最も大きな上目であり、魚類全体の約半数に当たる約15,000種が含まれる。タイ・サンマ・イワシ・カレイ・フグ・サバなど多くの海水魚とともに、メダカ・シクリッド・グッピーなどの淡水魚もこの上目に属する。

共同研究チーム

理化学研究所 脳神経科学研究センター システム分子行動学研究チーム
チームリーダー 吉原 良浩（ヨシハラ・ヨシヒロ）
テクニカルスタッフⅠ（研究当時）増田 美和（マスダ・ミワ）
研究員（研究当時）小出 哲也（コイデ・テツヤ）
副チームリーダー（研究当時）宮坂 信彦（ミヤサカ・ノブヒコ）
（現 研究基盤開発部門 生体物質分析支援ユニット ユニットリーダー）
テクニカルスタッフⅠ（研究当時）脇阪 紀子（ワキサカ・ノリコ）

東京大学大学院 農学生命科学研究科
教授 東原 和成（トウハラ・カズシゲ）
助教 伊原 さよ子（イハラ・サヨコ）
大学院生（研究当時）吉川 敬一（ヨシカワ・ケイイチ）
教授（研究当時）渡邉 秀典（ワタナベ・ヒデノリ）
特任講師（研究当時）森 直紀（モリ・ナオキ）

研究支援

本研究は、科学技術振興機構（JST）戦略的創造研究推進事業ERATO「東原化学感覚プロジェクト（研究総括：東原和成、研究分担者：吉原良浩）」、日本学術振興会（JSPS）科学研究費助成事業基盤研究（B）「ゼブラフィッシュ嗅覚系の神経回路網形成・機能構築原理の統合的解明（研究代表者：吉原良浩）」、同新学術領域（研究領域提案型）「ゼブラフィッシュにおける嗅覚記憶ダイナミズムの分子・細胞・神経回路メカニズム（研究代表者：吉原良浩）」、三菱財団自然科学研究助成「嗅覚忌避行動の分子・神経基盤の解明（研究代表者：吉原良浩）」および花王株式会社による助成を受けて行われました。

原論文情報

• Miwa Masuda*, Sayoko Ihara*, Naoki Mori, Tetsuya Koide, Nobuhiko Miyasaka, Noriko Wakisaka, Keiichi Yoshikawa, Hidenori Watanabe, Kazushige Touhara, Yoshihiro Yoshihara *These authors contributed equally to this study, "Identification of Olfactory Alarm Substances in Zebrafish", Current Biology, 10.1016/j.cub.2024.02.003

発表者

理化学研究所
脳神経科学研究センター システム分子行動学研究チーム
チームリーダー 吉原 良浩（ヨシハラ・ヨシヒロ）
テクニカルスタッフⅠ（研究当時）増田 美和（マスダ・ミワ）

東京大学大学院 農学生命科学研究科
教授 東原 和成（トウハラ・カズシゲ）
助教 伊原 さよ子（イハラ・サヨコ）

報道担当

理化学研究所 広報室 報道担当
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