理化学研究所（理研）生命医科学研究センター タンパク質機能・構造研究チームの白水 美香子 チームディレクター、新野 睦子 上級技師、篠田 雄大 研究員らの共同研究グループは、細胞の運動を促進するタンパク質「DOCK5[1]」とその結合パートナーである「ELMO1[2]」が、上流のシグナル因子であるGタンパク質[3]「RhoG[3]」と脂質膜[4]との相互作用によって大きく形を変え、基質であるGタンパク質「Rac1[3]」を活性化させ、下流へシグナルを伝達する仕組みを、クライオ電子顕微鏡法[5]を用いた構造解析により解明しました。
本研究成果は、細胞の接着や運動性が深く関与している骨粗しょう症や浸潤がんの治療に向けた創薬研究に貢献すると期待されます。
細胞の運動は、免疫応答や神経突起の形成、がんの転移など、体における多くの重要なプロセスに関与しています。Gタンパク質Rac[3]は、アクチン細胞骨格[6]を制御し細胞の形態変化を誘導することで、がん細胞の運動を促進します。DOCKファミリータンパク質[1]はRacの活性化に関わりますが、この機能には細胞膜[4]が重要な役割を担っていると考えられています。しかし、細胞膜がDOCKタンパク質[1]とどのようにして協調して機能するのかは不明でした。
今回、共同研究グループは、脂質膜上に結合したDOCK5とその結合パートナーであるELMO1との複合体に、上流のシグナル因子RhoGと基質Rac1が結合した構造を、クライオ電子顕微鏡法を用いて決定しました。そして、決定した構造に基づくDOCK5とELMO1変異体の機能解析により、細胞膜との結合によって生じるDOCK5とELMO1の大きな構造変化と、この変化によって生じるELMO1と細胞膜との新たな相互作用が、細胞の運動性と関わるアクチン細胞骨格の制御に重要な役割を果たすことを突き止めました。
本研究は、科学雑誌『Communications Biology』オンライン版（11月13日付：日本時間11月13日）に掲載されます。
脂質膜上の複合体の活性型コンフォメーション（立体構造）と細胞膜が関わる構造変化
背景
DOCKファミリータンパク質は、酵母菌、線虫のような微小生物からヒトに至るまで進化的に保存された分子群で、細胞運動の調節に重要な役割を果たしています。細胞の運動は、免疫応答や神経突起の形成、がんの転移など、体のさまざまな重要なプロセスに関与しています。DOCKタンパク質は、RacやCdc42[3]などのGタンパク質に結合したGDP（グアノシン二リン酸）をGTP（グアノシン三リン酸）に交換することによって、これらのGタンパク質を活性化します。活性化されたGタンパク質は細胞骨格であるアクチンタンパク質の重合を促進し、細胞の形態を変化させることで細胞の運動を制御します。Racは、がん細胞が運動方向に伸ばす膜突起の形成にも関与することが知られています。
DOCKタンパク質とその結合パートナーであるELMOタンパク質[2]には細胞膜との相互作用に関わる構造モチーフ（超二次構造）が備わっています。また、基質であるRacやDOCKタンパク質の活性制御に関わる上流のシグナル因子RhoGはいずれも細胞膜につなぎ留められていることが知られています。このようなことから、DOCKタンパク質によるRacの活性化は細胞膜上で行われると考えられています。
白水チームディレクターらは先行研究において、細胞の形態変化や細胞運動に関わるDOCK5とELMO1、そして基質であるRac1との複合体を、クライオ電子顕微鏡法を用いた構造解析によって決定し、ELMO1がRac1の活性化を助ける仕組みを明らかにしました注1）。一方で、この構造は水溶液中の状態を捉えたものであったことから、Rac1の活性化機構において細胞膜がどのように関わるのかは不明なままでした。
今回、共同研究グループは、細胞膜上に近い条件下でDOCK5、ELMO1、RhoGおよびRac1から成る複合体についてクライオ電子顕微鏡法を用いた構造解析によって、細胞膜がDOCK5によるRac1の活性化にどのように関わるか観察しました。
- 注1）2021年7月22日プレスリリース「細胞の動きを制御するタンパク質の巧妙な仕組み」
研究手法と成果
共同研究グループは、クライオ電子顕微鏡観察用グリッド[7]上に任意の脂質膜を形成し、その膜上にDOCKタンパク質やGタンパク質を再構成できる新しい手法を開発しました（図1）。
図1 膜貼付グリッドを使ったクライオ電子顕微鏡用サンプル作製方法
揮発性溶媒に溶かした脂質を緩衝液のドロップ上に静かに置いて溶媒のみを揮発させると、緩衝液のドロップ表面（気液界面）に脂質一重膜が形成される。「膜貼付グリッド」とはこの膜をクライオ電子顕微鏡観察用グリッドの表面に吸着させたものである。この膜貼付グリッドを解析対象のDOCK-ELMO複合体やRhoG/Rac1を混合したタンパク質溶液（サンプル液）のドロップ上に置いて数分間反応させると、脂質膜上にこれらのタンパク質の複合体が形成される。反応後、未吸着あるいは非特異的に脂質膜上に吸着したタンパク質を緩衝液で洗浄・除去し、ろ紙で余分な緩衝液を除いた後に液体エタンで瞬間凍結したグリッドをクライオ電子顕微鏡で観察する。
この手法を用いて、酸性脂質（ホスファチジン酸（PA）[8]およびホスファチジルイノシトール三リン酸（PIP3）[8]）を含む脂質膜上にDOCK5-ELMO1複合体と2種のGタンパク質Rac1およびRhoGを再構成し、クライオ電子顕微鏡観察および構造解析を行ったところ、脂質膜上に平らに広がったDOCK5-ELMO1-Rac1-RhoG複合体の特徴的な立体構造を、約7オングストローム（Å、1Åは100億分の1メートル）の分解能で捉えることに成功しました（図2A、B）。
先行研究で解明された、タンパク質が自らの一部で活性を抑えている自己阻害型構造では、ELMO1のN末端[9]がDOCK5の触媒ドメインDHR-2（DOCK5のDHR-2ドメイン）を覆うように結合していましたが（図2C）、今回得られた構造では、N末端がDHR-2から大きく離れて脂質膜に沿って開くことで、DOCK5、ELMO1、RhoG、Rac1の4分子が膜上に整列する構造を形成していることが明らかになりました（図2B）。また、構造比較の結果、この扁平（へんぺい）な構造はDOCK5分子内のヒンジ部位で約20度の回転が生じることによって形成されることが分かりました（図2D）。そして、この大きな構造変化によってELMO1PHドメインが脂質膜側へ大きく向きを変えることも分かりました（図2E）。
これらの構造的特徴について変異体を使った生化学的検証を行ったところ、脂質膜上で観察された扁平な構造への大きな構造変化はDOCK5のグアニンヌクレオチド交換活性[1]に関わることが示されました。また、構造変化によって脂質膜に近づいたELMO1 PHドメインのVL1と呼ばれるループ上の塩基性アミノ酸が酸性脂質と相互作用することが判明しました。これらの結果は、DOCK5の構造変化が脂質膜との新しい結合様式と活性化制御への密接な関与を示唆しています。加えて、同じ変異型を発現させた細胞でアクチン細胞骨格の挙動を解析したところ、細胞の周縁部へのアクチン繊維の集積やラメリポディア[10]形成への関与が判明しました。この結果はDOCK5-ELMO1複合体の構造変化と脂質膜との相互作用が、DOCK5の下流シグナル経路に当たる、細胞の運動性と関わるアクチン細胞骨格の制御に重要な役割を果たしていることを示唆しています。
図2 脂質膜上で解明されたDOCK5-ELMO1-Rac1-RhoG複合体のクライオ電子顕微鏡構造
（A、B）クライオ電子顕微鏡法で解明された、脂質膜に結合したDOCK5-ELMO1-Rac1-RhoG複合体のクーロンポテンシャルマップ（A）、およびこのマップを用いて決定された立体構造モデル（B）。マップはモデルの色に合わせて、タンパク質分子ごとに色分けした。ELMO1NTD：ELMO1 N末端ドメイン、CTD：ELMO1 C末端ドメイン。（C）先行研究によって解明された、DOCK5-ELMO1複合体（自己阻害型）の立体構造モデル。（D）先行研究の自己阻害型構造と本研究の活性型構造を、DOCK5のDHR-2ドメインで重ねて比較したモデル。比較によって明らかとなった構造変化の動きを赤色の矢印で示した。（E）本研究の活性型構造への大きな構造変化によって細胞膜に近づいたELMO1PHドメインのVL1ループ。
図3は、これまでの知見と本研究成果に基づくDOCK5-ELMO1複合体の脂質膜上での構造変化モデルを示しています。細胞質中では主に自己阻害型で存在するDOCK5-ELMO1複合体が、PIP3との相互作用をきっかけに細胞膜へ結合し、RhoGや酸性脂質との相互作用を経て大きく構造を変化させ、最終的に基質Rac1をDHR-2ドメインに取り込むことができる活性化状態へ移行することが明らかになりました。本研究で明らかにした構造変化の仕組みは、ELMOタンパク質を結合パートナーとするDOCK-AおよびDOCK-Bのサブファミリーにも共通する基本的な分子メカニズムであると考えられますが、サブファミリーのメンバーによって異なる制御機構も考えられるため、今後の解析も待たれます。
図3 細胞膜上でのDOCK5-ELMO1複合体の構造変化
（上）DOCK5のPIP3結合サイトと細胞膜上のPIP3との相互作用によって、自己阻害型コンフォメーション（立体構造）のDOCK5-ELMO1複合体が細胞膜に結合する。（下）その後、ELMO1のN末端ドメイン（ELMO1NTD）がDOCK5のDHR2ドメインから解離し、細胞膜上のRhoGと結合する。このELMO1NTDの解離によって暴露されたPHドメインが、DOCK5の構造変化を伴って脂質膜上の酸性脂質と相互作用する。最終的にDOCK5の構造変化によってDOCK5-ELMO1複合体は細胞膜に沿うような扁平な活性型コンフォメーションとなる。このとき、DOCK5ヒンジ部位とPHドメインとの間で相互作用を生じる。
今後の期待
DOCKタンパク質は、アクチン細胞骨格の構築を介して、神経の形成や免疫機能、がんの進展に関与することが知られています。中でもDOCK5は、破骨細胞が骨に接着する際に機能することで骨吸収を調整する役割を担っており、抗骨粗しょう症薬の開発ターゲットとしても期待されている分子です。また、上皮細胞の浸潤・転移を促進し、がんの進行に関与することも知られていることから、本研究により得られた知見が、これらの疾病に対する治療薬開発を加速させることが期待されます。
さらに、本研究内で開発した、クライオ電子顕微鏡観察用グリッド上に形成した任意の脂質膜上に解析対象のタンパク質複合体を再構成させる手法は、脂質膜と相互作用するタンパク質の立体構造を細胞内環境に近い状態で捉えることを可能にするため、今後幅広い応用が期待されます。
補足説明
- 1.DOCK5、DOCKファミリータンパク質、DOCKタンパク質、グアニンヌクレオチド交換活性
DOCKタンパク質はGDP結合型（不活性型）Racタンパク質からGDPを乖離（かいり）させ、GTP結合型への変換を促進する機能を持つグアニ-ンヌクレオチド交換活性因子の一種。機能・構造が類似したDOCKファミリータンパク質を構成する。哺乳類のDOCKファミリータンパク質には11種のDOCKタンパク質が含まれ、DOCK-A～Dの四つのサブファミリーに細分される。DOCK5はDOCK-Aサブファミリーに属する。DOCKはdedicator of cytokinesisの略。 - 2.ELMO1、ELMOタンパク質
ELMOタンパク質は複数のタンパク質に結合し、タンパク質複合体形成の「足場（スキャッフォルド）」となるタンパク質の一種で、ELMO1はその一つ。ELMOはengulfment and cell motilityの略。 - 3.Gタンパク質、RhoG、Rac1、Rac、Cdc42
Gタンパク質は、グアニンヌクレオチド結合タンパク質の総称。グアノシン二リン酸（GDP）が結合している不活性型と、グアノシン三リン酸（GTP）が結合している活性型の間でタンパク質のコンフォメーション（立体構造）が変化し、分子スイッチとして働く。DOCKが関わるシグナル伝達経路では、RhoGはシグナル上流の調整役としてDOCKを活性化させる。RacとCdc42は細胞の形態変化と運動を制御する分子スイッチであり、DOCKとの結合によってグアニンヌクレオチド交換を受けて活性型に変化する。Rac1はRacサブファミリーメンバーの一つで、DOCK5の基質である。 - 4.脂質膜、細胞膜
細胞膜は、細胞の外側の薄い膜。実態は、主にリン脂質が集まって形成された脂質二重膜である。細胞の形を支え、細胞内外の物質の行き来を制限することが主な役割であるが、シグナル伝達に関わる多様なタンパク質が局在する場ともなっているため、外部の刺激を受信する細胞のインターフェースとしての役割もある。脂質膜とは、この細胞膜を模倣し、脂質のみを用いて人工的に作製した膜のことを指す。 - 5.クライオ電子顕微鏡法
タンパク質などの試料を液体エタン中で急速凍結して、薄い氷の層に閉じ込め、透過型電子顕微鏡を用いて観察する手法。画像処理により、観察された粒子の立体構造情報を得ることができる。 - 6.アクチン細胞骨格
細胞の運動を調節するために必要な繊維状の構造で、アクチンタンパク質が重合して形成される。がん細胞が浸潤する際に細胞膜に形成される突起構造の中心となる。 - 7.クライオ電子顕微鏡観察用グリッド
直径3ミリメートルの小さな金属の網目状プレート。解析対象のタンパク質試料をその上にのせ、極低温で急速に凍結することで、タンパク質を自然な形のまま観察できる。 - 8.ホスファチジン酸（PA）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（PIP3）
細胞膜をつくる脂質の一種。これらの脂質は単なる膜の材料ではなく、細胞内の情報伝達を担うメッセンジャー分子や細胞の応答を制御するスイッチとして重要な役割を果たしている。 - 9.N末端
タンパク質はアミノ酸同士が脱水縮合して形成されたポリマーであり、隣接するアミノ酸は、それぞれのアミノ基とカルボキシ基がペプチド結合をしている。このポリマーの末端のフリーのアミノ基側をN末端、カルボキシ基側をC末端と呼ぶ。 - 10.ラメリポディア
細胞の前端に形成される広くて薄い膜状の突起。主にアクチンフィラメントの重合によって形成され、細胞の遊走や接着に関与し、これにより細胞は周囲の環境に応じて方向性を持って移動できる。なお、ラメリポディアと類似のフィロポディアは細長い指状の突起で、これも主にアクチンフィラメントの重合によって形成される。
共同研究グループ
理化学研究所 生命医科学研究センター
タンパク質機能・構造研究チーム
チームディレクター 白水 美香子（シロウズ・ミカコ）
（創薬タンパク質解析基盤ユニット ユニットリーダー、構造生命科学／細胞生物学連携チーム 上級研究員）
上級技師 新野 睦子（ニイノ・ムツコ）
研究員 篠田 雄大（シノダ・タケヒロ）
上級テクニカルスタッフ 桂 一茂（カツラ・カズシゲ）
テクニカルスタッフⅠ 桂 芳子（カツラ・ヨシコ）
テクニカルスタッフⅠ 花田 和晴（ハナダ・カズハル）
創薬タンパク質解析基盤ユニット
テクニカルスタッフⅠ 米持 まゆ美（ヨネモチ・マユミ）
東京薬科大学 生命科学部 分子生命科学科 分子神経科学研究室
教授 山内 淳司（ヤマウチ・ジュンジ）
国立成育医療研究センター 薬剤治療研究部
上級研究員 宮本 幸（ミヤモト・ユキ）
研究支援
本研究は、科学技術振興機構（JST）戦略的創造研究推進事業CREST「クライオ電顕による DOCK シグナロソームの動的構造の解明（研究代表者：白水美香子）」および理研・新領域開拓課題「細胞内環境の生物学」による助成を受けて行われました。
原論文情報
- Takehiro Shinoda, Kazushige Katsura, Yoshiko Ishizuka-Katsura, Kazuharu Hanada, Mayumi Yonemochi, Yuki Miyamoto, Mutsuko Kukimoto-Niino, Junji Yamauchi, Mikako Shirouzu, "Conformational alteration of DOCK5oELMO1 signalosome on lipid membrane", Communications Biology, 10.1038/s42003-025-09113-5
発表者
理化学研究所
生命医科学研究センター タンパク質機能・構造研究チーム
チームディレクター 白水 美香子（シロウズ・ミカコ）
上級技師 新野 睦子（ニイノ・ムツコ）
研究員 篠田 雄大（シノダ・タケヒロ）
報道担当
理化学研究所 広報部 報道担当
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