要旨

理化学研究所（理研）吉田化学遺伝学研究室の凌楓（リン・フォン）専任研究員、吉田稔主任研究員、国立精神・神経医療研究センター（NCNP）メディカル・ゲノムセンターの後藤雄一センター長らの共同研究グループは、細胞分裂後にできる娘細胞にミトコンドリアDNA（mtDNA）からなる「線状多量体（コンカテマー）^[1]」が送り込まれることでミトコンドリアゲノムの初期化が促進されるという、mtDNA複製と分配の新しいメカニズムを発見しました。

1つの細胞には、数千個ものミトコンドリアが存在します。ミトコンドリアゲノムは加齢に伴い変異が蓄積し、成人の体細胞で変異型mtDNAと正常型mtDNAが混在した「ヘテロプラスミー^[2]」という状態になります。さらに、変異型mtDNAの比率が一定以上になるとミトコンドリアの機能が低下し、ミトコンドリア病^[3]などを発症することが知られています。一方、新生児のミトコンドリアは、ほぼ全てが正常型mtDNAで占める「ホモプラスミー^[2]」状態となっています。遺伝の過程で起きるヘテロプラスミーからホモプラスミーへの“リセット”による健全化は、卵子形成あるいは発生の段階でミトコンドリアゲノムが初期化されるために起こると考えられています。しかし、その分子メカニズムは未解明でした。

共同研究グループは、ミトコンドリア病患者由来のヘテロプラスミー状態の細胞に、適度な濃度の過酸化水素（H₂O₂）を加えて活性酸素種（ROS）^[4]を発生させた後、mtDNAを観察しました。すると1つの複製開始点から連続的にmtDNAが複製（ローリングサークル型複製^[5]）され、多数のミトコンドリアゲノムが直鎖上につながったコンカテマーが形成されることが分かりました。さらにこれらの細胞では、細胞分裂の際に少数の鋳型からできた多数のコピーが娘細胞へ継承され、ミトコンドリアゲノムの“不均等な分配”が起こるため、正常型と変異型の混在が解消されホモプラスミーとなることが明らかになりました。

この結果は、従来の遺伝子の複製機構では説明できなかったミトコンドリアゲノムの初期化機構に、ROSによるローリングサークル型複製の活性化が関与することを示しています。本研究は、母系遺伝（細胞質遺伝）を担うmtDNAの複製・分配機構の解明を通じて、どのような機構を経てミトコンドリア機能を健全化した子孫が誕生するかという、生命の基本原理の理解に迫るものです。

成果は、米国の科学雑誌『Molecular Biology of the Cell』（5月15日号）に掲載されるのに先立ち、オンライン版（3月23日付け：日本時間3月24日）に掲載されています。

※共同研究グループ

理化学研究所
吉田化学遺伝学研究室
専任研究員 凌 楓 （リン・フォン）
協力研究員 牛 栄 （ニュー・ロン）
主任研究員 吉田 稔 （よしだ みのる）

理化学研究所
名誉研究員 柴田 武彦 （しばた たけひこ）

国立精神・神経医療研究センター
メディカル・ゲノムセンター／神経研究所疾病研究第二部
センター長／部長 後藤 雄一 （ごとう ゆういち）
CREST研究員 畠山 英之 （はたけやま ひでゆき）

背景

ミトコンドリアは、細胞のエネルギーであるATP（アデノシン三リン酸）の生産工場です。また、ミトコンドリアは真核生物の祖先に寄生したバクテリアの子孫といわれ、その名残として、細胞核とは別に独自のミトコンドリアDNA（mtDNA）を持っています。

mtDNAは1つの細胞に数千個ほど存在します。ミトコンドリアによる酸素呼吸は、副産物として活性酸素種（ROS）を発生し、その作用でmtDNAがしばしば突然変異して変異型となります。加齢に伴い変異型mtDNAが蓄積すると、細胞内で正常型と変異型が混在した「ヘテロプラスミー」になっていきます。そして、変異型の比率がある閾値（いきち）を超えると、ミトコンドリア病、糖尿病、神経変性疾患、がんなどを発症させることが知られています。一方で、健康な新生児のmtDNAは、ほとんど正常型だけで構成される「ホモプラスミー」です。人工多能性幹細胞（iPS細胞）では核ゲノムが初期化されますが、ミトコンドリアはヘテロプラスミー状態のままであるため、高齢者の細胞から作成したiPS細胞には問題があることもわかってきました。^注1）遺伝の過程で起きるヘテロプラスミーからホモプラスミーへの“リセット”は、酵母からヒトまで共通にみられ、卵子形成あるいは発生の段階でミトコンドリアゲノムが初期化されるために起きると考えられています。しかし、その分子メカニズムは解明されていません。

ヒトのmtDNAは、塩基配列が全長16.5kb（キロ塩基対）の環状DNAです。これまでそれは、同じ環状DNAを持つバクテリアなどと同じように、細胞分裂の際は「シータ型複製（θ型複製）^[6]」様式で増えると考えられてきました。しかし、θ型複製様式では正常型と変異型の増える機会が等しいため、変異していないmtDNAだけを増やして、ヘテロプラスミーをホモプラスミーにリセットする現象を説明することはできません。

一方で、共同研究グループは2006年にモデル生物である出芽酵母^[7]において、ROSを発生させる処理を行うと、ヘテロプラスミーのmtDNAの“不均等分配”を誘導して酵母mtDNAがホモプラスミー化することを報告しています^注2）。そこで今回、ヒト細胞でも同様の現象がみられるかどうかを確かめようと考えました。

注1）Kang, E., Wang, X., Tippner-Hedges, R., Ma, H., Folmes, C.D.L., Gutierrez, N.M., Lee1, Y., Dyken, C.V., Ahmed, R., Y., L., et al. (2016). Age-Related Accumulation of Somatic Mitochondrial DNA Mutations in Adult-Derived Human iPSCs. Cell stem cell 18, 1-12. Doi:10.1016/j.stem.2016.02.005, in press.
注2）2006年12月5日プレスリリース「ミトコンドリアDNAの複製の常識の一端が覆る」

研究手法と成果

共同研究グループはまず、ミトコンドリア病患者由来のヘテロプラスミー状態の線維芽細胞（結合組織を構成する細胞の1つ）を過酸化水素（H₂O₂）で処理してROSを発生させた後、mtDNAを観察しました。その結果、ROS発生後のROS濃度が発生前の2.4倍になるようにH₂O₂で処理をした場合のみ、正常型mtDNAと変異型mtDNAの比率が著しく変化した細胞が出現し、ホモプラスミー化が起こったことが分かりました。

次にパルスフィールド電気泳動^[8]などを用いて、ホモプラスミー化したmtDNAを解析したところ、塩基配列16.5kbのmtDNAの量が減少し、より分子量の大きなDNAが観察されました。この大きなDNAを解析した結果、θ型複製の中間体ではなく、多数のミトコンドリアゲノムが直鎖上につながった「線状多量体（コンカテマー）」であることが分かりました。

細菌細胞内で増殖するウイルスのバクテリオファージなどでは、コンカテマーはローリングサークル型複製によって形成されることが知られています。そこで、ROSを発生させたヒト細胞のミトコンドリアでローリングサークル型複製が起こっているかどうかを調べたところ、ローリングサークル型複製の中間体のDNAが観察されました。したがって、ヒト細胞でミトコンドリアゲノム複製の際、ROSがDNA組換えを介したローリングサークル型複製を誘発することが分かりました。

最後に、外から加えたROSではなく、ヒト細胞内で自然に生じるROSでも同じ現象が起きるかどうかを調べました。細胞にmtDNAの複製を阻害するエチジウムブロミド（EtBr）を一過的に加えると、mtDNAのコピー数が減少し、ROSが発生することが知られています。一過的なEtBr処理後の細胞のmtDNAを調べると、H₂O₂処理と同様、mtDNAコピー数の減少によって複製の鋳型も減少することになり、これに加えてミトコンドリアゲノムが直鎖上につながったコンカテマーが形成されることで、細胞のホモプラスミー化が観察されました。この効果は、ROSを消去するビタミンC処理をするとなくなったことから、細胞内で生じたROSによって誘導されたことが分かりました。

以上の結果は、ヘテロプラスミー状態にあるミトコンドリア病患者由来のヒト細胞において、細胞内で自然に生じた適度な濃度のROSがコンカテマーを形成するローリングサークル型複製を誘発し、mtDNAのホモプラスミー化を導くことを示しています。これは、いまだに解明されていないミトコンドリアゲノムの発生過程における初期化機構についても重要な情報を提供するものと考えられます。すなわち、コンカテマーがまとめて娘細胞や、それ以降の代の子孫細胞に送り込まれていくことで、子孫細胞の変異型mtDNAと正常型mtDNAの比率が変化し、ホモプラスミー化を促進するというモデルが考えられます（図1）。

今後の期待

本研究は、母系遺伝（細胞質遺伝）を担うmtDNAの複製・分配機構の解明を通じて、どのような機構を経てミトコンドリア機能を健全化した子孫が誕生するかという生命の基本原理の理解に迫るものです。また本成果は、病的ヘテロプラスミーのヒト体細胞を正常型mtDNAのみからなる健全なミトコンドリア機能を持つ細胞へ変換することが可能であることを示しており、将来ミトコンドリア異常に起因する疾患の治療法や高齢者由来のiPS細胞の安全な利用法の開発につながると期待できます。

原論文情報

• Feng Ling, Rong Niu, Hideyuki Hatakeyama, Yu-ichi Goto, Takehiko Shibata and Minoru Yoshida, "ROS stimulate mitochondrial allele segregation towards homoplasmy in human cells", Molecular Biology of the Cell, doi: 10.1091/mbc.E15-10-0690

発表者

理化学研究所
主任研究員研究室 吉田化学遺伝学研究室
専任研究員 凌 楓 （リン・フォン）
主任研究員 吉田 稔 （よしだ みのる）

国立精神・神経医療研究センター
メディカル・ゲノムセンター／神経研究所疾病研究第二部
センター長／部長 後藤 雄一 （ごとう ゆういち）

報道担当

理化学研究所 広報室 報道担当
Tel: 048-467-9272 / Fax: 048-462-4715

国立精神・神経医療研究センター 広報係
Tel: 042-341-2711（代表）
ncnp-kouhou [at] ncnp.go.jp（※[at]は@に置き換えてください。）

補足説明

• 1.線状多量体（コンカテマー）
  単位長さ（mtDNAでは16.5kb）のDNAが直鎖状に連結した構造体。
• 2.ヘテロプラスミー、ホモプラスミー
  1つの細胞の全てのmtDNAが同じ塩基配列を持つ状態を、ホモプラスミーという。mtDNAの突然変異などにより、塩基配列の異なるmtDNAが混在している状態をヘテロプラスミーという。
• 3.ミトコンドリア病
  細胞エネルギーを生産するミトコンドリアの機能低下に起因する病気の総称。種々の症状を呈し、脳卒中や精神症状、認知症、心筋症、糖尿病などが知られる。
• 4.活性酸素種（ROS）
  酸素分子が対になっていない電子を捕獲することで反応性の高くなったものの総称。ROSとはReactive Oxygen Speciesの略。
• 5.ローリングサークル型複製
  環状DNAを鋳型として頭-尾結合（head to tail）の線状多量体（コンカテマー）を合成していく複製様式である。5’-3’エキソヌクレアーゼによる二重鎖切断の過程で生じた単鎖DNAが、環状DNAと相同対合し、この単鎖DNAをプライマーとして複製が進行する。バクテリオファージがこの複製様式をとることが知られている。
• 6.シータ型複製（θ型複製）
  環状DNAの1カ所からRNA をプライマーとして両方向にDNA複製が進み、θの形をした中間体を経て2つのコピーの環状DNAが形成される複製様式のこと。
• 7.出芽酵母
  出芽によって増える酵母でこの名を得た。パン酵母やビール酵母などが知られている。パン酵母は、細胞生物学や遺伝学実験のモデル生物として広く使われている。
• 8.パルスフィールド電気泳動
  染色体のようなサイズが非常に大きいDNAを、アガロースゲル上で分離する方法である。コンカテマーは単位長さのmtDNA（16.5kb）が連結した、サイズが大きい線状の多量体であるが、この方法で環状のものと区別して検出することができる。