理化学研究所（理研）生命機能科学研究センター 生体非平衡物理学理研白眉研究チーム（研究当時）の深井 洋佑 研究員（研究当時、現 開拓研究所 川口生体非平衡物理学研究室 研究員）、川口 喬吾 理研白眉研究チームリーダー（研究当時、現 開拓研究所 川口生体非平衡物理学研究室 主任研究員、東京大学 大学院理学系研究科附属知の物理学研究センター 准教授）、エピジェネティクス制御研究チーム（研究当時）の若森 昌聡 技師（研究当時）、梅原 崇史 チームリーダー（研究当時、現 立命館大学 薬学部 教授）、東京大学 定量生命科学研究所 先端定量生命科学研究部門 クロマチン構造機能研究分野の鯨井 智也 講師、胡桃坂 仁志 教授らの共同研究グループは、真核生物の持つゲノム構造「クロマチン^[1]」を、設計したヒストン修飾^[2]パターンの下、試験管内で再構成する技術を開発し、約2万塩基対のDNAに対応する遺伝子スケール（一遺伝子座スケール）の長さを持つ再構成クロマチンの構造・動態の解析に成功しました。

本研究成果は、細胞の運命をつかさどる3次元ゲノム構造の構築原理を解明するための定量的な研究基盤を提供します。将来的には、ヒストンの修飾パターンからクロマチン構造や遺伝子発現・細胞機能を予測・制御する技術の開発につながると期待されます。

真核生物のゲノムは、ヒストンタンパク質の八量体^[3]にDNAが巻き付いたヌクレオソーム^[3]を基本単位とし、これが数珠状につながったクロマチンとして核に収められています。クロマチンの3次元構造はヒストンのアセチル化^[4]などの翻訳後修飾^[5]と相関して変化し、遺伝子発現や細胞の分化に関わります。

共同研究グループは、一遺伝子座スケールの長さを持つクロマチン（長鎖クロマチン）を、制御された修飾パターンの下で合成する手法を開発しました。この実験系により、ヒストンがアセチル化された領域のパターンに応じてヌクレオソームの接触頻度のパターンとクロマチン構造のゆらぎダイナミクスが大きく変化することを、一分子観察などの方法を用いて初めて直接実証しました。

本研究は科学雑誌『Science Advances』オンライン版（11月19日付：日本時間11月20日）に掲載されました。

背景

真核生物の細胞内では、DNAとヒストンタンパク質から成るクロマチンの3次元構造や動態が、遺伝子のオン・オフや細胞の運命決定に密接に関わっています（図1）。クロマチンは、ヒストンタンパク質の八量体にDNAが巻き付いたヌクレオソームと呼ばれる構造を基本単位として、それが数珠状につながった構造です。ヒストンがアセチル化などの翻訳後修飾（エピジェネティック修飾^[6]）を受けることで、局所的にクロマチンの3次元構造が変化するとともに、クロマチン領域に含まれる遺伝子の働き方が変わると考えられています。しかし細胞内では、ヒストンに結合するタンパク質や、修飾を書き換えるタンパク質など多様な因子が同時に働くため、特定の修飾だけが構造に与える直接的な効果を遺伝子スケールで調べるのは困難でした。また、試験管内（in vitro）で再構成したクロマチンを用いてエピジェネティック修飾とクロマチン構造の関係を直接測定しようとした研究の多くは、ヌクレオソームが12個程度つながった、DNAにして数千塩基対程度の大きさを対象としたものに限られています。ヒトの遺伝子座は1万から100万塩基対と推定されており、これまでの再構成クロマチンの実験ではこのような一遺伝子座スケールの長さに及ぶ非一様な修飾パターンの効果は再現できていませんでした。

研究手法と成果

共同研究グループは、約2万塩基対に相当する、96個のヌクレオソームから成る一遺伝子座スケールのクロマチン（長鎖クロマチン）を再構成するに当たり、12ヌクレオソームを持つクロマチンを決まった順序で連結することで、設計した通りの修飾パターンを持つクロマチンを再構成する新しい手法を開発しました（図2左）。これにより、全ての位置でヌクレオソームがH4タンパク質のテール（ヌクレオソームの外に出ている部分）がアセチル化されたヒストンで構成されたものや、中央部の48ヌクレオソームのみがアセチル化されたもの、12ヌクレオソームごとに交互にアセチル化されたものといった、事前に設計した非一様性を持つようなクロマチンを構築することが可能になりました。原子間力顕微鏡^[7]を用いて直接分子全体を見ることで、設計通りに96ヌクレオソームを持つ長鎖クロマチンが再構成できていることを確認できました（図2右）。

この長鎖クロマチンの特性を調べるため、分子の両末端を蛍光標識し、単一分子を顕微鏡で観察する実験系を構築しました（図3A）。これにより、末端間の距離のゆらぎの大きさや、構造変化にかかる時間を測ることに成功し、例えば生理的な塩濃度では、アセチル化密度が高いほど空間的ゆらぎが増大し、構造変化が遅くなることを明らかにしました（図3B、C）。これは、アセチル化によりヌクレオソーム間の引力が弱まり、クロマチンが折れ曲がりにくくなることで、より広がった構造を取ることを示唆しています。塩濃度を3分の1程度にするとこの違いは見えなくなることなど、今まで知られていなかった特性も明らかになりました（図3C）。さらに、クロマチン端点のゆらぎの空間的な大きさと時間スケールの間の関係を初めて精密に測定することができ、それにより液中にある長鎖クロマチンの動態の説明には、周囲の水の流れの影響（流体力学的相互作用）を考慮する必要があることが示唆されました（図3C、D）。

クロマチンが3次元的に折り畳まれた構造を取ると、直鎖状では離れた位置にあるヌクレオソーム同士が接触する確率が高まります。近年、個々のヌクレオソーム間の接触確率（コンタクトマップ^[8]）を計測する「Hi-C法^[9]」を用いたクロマチンの核内構造の解析が進み、クロマチンがコンパートメント^[10]に分かれる構造やある領域内で凝縮するドメイン構造などを取ること、ヒストン修飾のパターンがクロマチン構造と相関することなどが分かってきました。

そこで、長鎖クロマチンの構造の特徴をさらに調べるため、試験管内で再構成したクロマチンにHi-C法を適用できるようにした「in vitro Hi-C法^[9]」を開発し、ヒストン修飾のみでどのようにヌクレオソーム間の接触確率が変化するのかを調べました（図4）。この結果、試験管内で構成された純粋なクロマチンにおいても、アセチル化はヌクレオソームの接触頻度を低下させ、開いたクロマチン構造を誘導すること、また非一様な修飾パターンではアセチル化領域と非アセチル化領域の相互接触確率が大きく異なり、それによりドメイン境界のようなものが形成されることを初めて実証しました。

今後の期待

本研究は、ヒストン以外のタンパク質などがないクロマチンのみという最小再構成系において、ヒストン修飾がクロマチンの3次元構造に観察可能なレベルの変化をもたらすことを、一遺伝子座スケールの再構成クロマチンを用いて明らかにしました。今後この実験系を土台として、他の修飾・結合因子や、ゲノム情報を読み出す転写プロセスなどを順次導入することで、細胞核内の多様な因子が関わる環境において、クロマチン3次元構造がどのように組み上がり、機能するのかを明らかにできると期待されます。さらに本手法は、ヒストンの修飾パターンを設計し、クロマチンの構造、ダイナミクス、コンタクトマップへの影響を体系的に測ることを可能とする初めての系であり、エンハンサー領域^[11]や遺伝子クラスターの人工設計、タンパク質修飾関連薬剤の作用機序の検証などへの展開も考えられます。

補足説明

• 1.クロマチン
  ヌクレオソーム（[3]参照）が連なってできた複合体。真核生物の細胞核内で、DNAを効率よく収納しつつ、遺伝子発現の制御にも関わる。
• 2.ヒストン修飾
  ヒストンタンパク質の一部に化学的な修飾（アセチル化やメチル化など）が加わること。これによりクロマチン構造が変化し、遺伝子の働きが調節される。
• 3.ヒストンタンパク質の八量体、ヌクレオソーム
  ヒストンタンパク質の八量体は、4種類のヒストンタンパク質（H2A、H2B、H3、H4）がそれぞれ二つずつ組み合わさったものを指す。この八量体にDNAが巻き付き、クロマチンの基本単位であるヌクレオソームとなる。ヌクレオソームが数珠状に連なりクロマチンを形成する。本稿ではヒストンタンパク質の八量体のことを単にヒストンと呼ぶこともある。
• 4.アセチル化
  ここでは、ヒストンタンパク質のテール（ヌクレオソームの外に出ている部分）にあるリジン残基にアセチル基が付加されるヒストン修飾（[2]参照）を指す。DNAや他のヌクレオソームとの結合が弱まり、クロマチンが「開いた」状態になりやすくなると考えられている。
• 5.翻訳後修飾
  タンパク質がDNAの情報を基につくられた（翻訳された）後に化学基の置換などの修飾を施されること。
• 6.エピジェネティック修飾
  DNA配列を変えずに、ヒストン修飾やDNAメチル化などを通してクロマチンが修飾されること。修飾によっては遺伝子の発現状態を変化させることがあり、細胞の分化や記憶にも関与する。
• 7.原子間力顕微鏡
  非常に細い探針で試料表面をなぞり、ナノメートル（10億分の1メートル）スケールの凹凸や形状を観察する顕微鏡。柔らかい生体分子の観察にも使える。
• 8.コンタクトマップ
  Hi-C法（[9]参照）で得られる、DNA上の各位置同士の接触頻度を表す図。クロマチンの折り畳み方や領域構造を可視化できる。
• 9.Hi-C法、in vitro Hi-C法
  DNAの中でどの部分同士が物理的に近いか（接触しているか）を調べる実験手法。クロマチンの立体構造を地図のように描ける。in vitro（イン・ヴィトロ）は、「試験管内で」を意味し、細胞内のクロマチンではなく再構成したクロマチンに対して手法を適用できることを示す。
• 10.コンパートメント
  Hi-C法により、染色体上には約100万塩基対程度にわたって相互作用頻度の高い一つながりのDNA領域（ドメイン）が見いだされた。コンパートメントは、類似の性質（転写が活性化しているか、抑制されているか）を持つドメインが集まったもので、核内で相互排他的な（混ざり合わない）領域を核内空間に形成していると考えられている。
• 11.エンハンサー領域
  遺伝子の本体部分から離れた上流や下流に位置し、遺伝子の転写効率を変化させる特定のDNA配列のうち、転写効率を高める（エンハンスする）部分をエンハンサー領域（配列）という。

共同研究グループ

理化学研究所
生命機能科学研究センター
生体非平衡物理学理研白眉研究チーム（研究当時）
研究員（研究当時）深井 洋佑（フカイ・ヨウスケ）
（現 開拓研究所 川口生体非平衡物理学研究室 研究員）
テクニカルスタッフⅠ（研究当時）金村 節子（カナムラ・セツコ）
（現 開拓研究所 川口生体非平衡物理学研究室 テクニカルスタッフⅠ）
テクニカルスタッフⅠ（研究当時）山内 里紗（ヤマウチ・リサ）
（現 開拓研究所 川口生体非平衡物理学研究室 上級テクニカルスタッフ）
テクニカルスタッフⅠ（研究当時）ゼラアティ・ソマイエ（Zeraati Somayeh）
（現 開拓研究所 川口生体非平衡物理学研究室 テクニカルスタッフⅠ）
理研白眉研究チームリーダー（研究当時）川口 喬吾（カワグチ・キョウゴ）
（現 開拓研究所 川口生体非平衡物理学研究室 主任研究員、東京大学 大学院理学系研究科 附属知の物理学研究センター 准教授）
エピジェネティクス制御研究チーム（研究当時）
技師（研究当時）若森 昌聡（ワカモリ・マサトシ）
チームリーダー（研究当時）梅原 崇史（ウメハラ・タカシ）
（現 立命館大学 薬学部 教授）
発生ゲノムシステム研究チーム
専門技術員 種子島 千春（タネガシマ・チハル）
技師 門田 満隆（カドタ・ミツタカ）
生命医科学研究センター
創薬タンパク質解析基盤ユニット
テクニカルスタッフⅠ 森田 鋭（モリタ・サトシ）
ユニットリーダー 白水 美香子（シロウズ・ミカコ）

東京大学 定量生命科学研究所 先端定量生命科学研究部門
クロマチン構造機能研究分野
講師 鯨井 智也（クジライ・トモヤ）
教授 胡桃坂 仁志（クルミザカ・ヒトシ）

研究支援

本研究は、理化学研究所運営費交付金（理研白眉、生命機能科学研究）で実施し、日本学術振興会（JSPS）科学研究費助成事業新学術領域研究（研究領域提案型）「情報物理学でひもとく生命の秩序と設計原理（領域代表者：岡田康志、研究代表者：岡田康志、JP19H05795）」「遺伝子制御の基盤となるクロマチンポテンシャル（領域代表者：木村宏、研究代表者：川口喬吾、JP19H05275）」、同学術変革領域研究（A）「個体の細胞運命決定を担うクロマチンのエピコードの解読（領域代表者：立花誠、研究代表者：胡桃坂仁志、JP24H02328）」「ＤＮＡの物性から理解するゲノムモダリティ（領域代表者：西山朋子、研究代表者：梅原崇史、JP21H05764）」「進化情報アセンブリによる生命機能の創出原理（領域代表者：小林徹也、研究代表者：川口喬吾、JP25H01361）」、同基盤研究（S）「クロマチンにおけるDNA修復機構の構造基盤の解明（研究代表者：胡桃坂仁志、JP23H05475）」、同基盤研究（A）「細胞内構造を支えるヘテロポリマー間相互作用の網羅的解析（研究代表者：川口喬吾、JP23H00095）」、同基盤研究（B）「がん細胞で頑強に維持される超アセチル化エピゲノムを操作する（研究代表者：梅原崇史、JP20H03388）」「リシンアセチル化による後成遺伝情報の発現と継承の仕組みを理解する（研究代表者：梅原崇史、JP24K02184）」「自己駆動する集団におけるカイラル輸送現象の研究（研究代表者：早田智也、JP21H01007）」、同若手研究「長鎖クロマチンの再構成・一分子観察で探る修飾パターン依存的な構造と機能（研究代表者：深井洋佑、JP22K14016）」「クロマチン構造における自然免疫制御機構の解明（研究代表者：鯨井智也、JP22K15033）」、同挑戦的研究（開拓）「細胞内のクロマチンにおける多様な転写機構の構造基盤（研究代表者：鯨井智也、JP23K17392）」、科学技術振興機構（JST）戦略的創造研究推進事業 ACT-X「長鎖クロマチンの3D構造観察に基づく物理モデル推定（研究代表者：深井洋佑、JPMJAX24LF）」、同戦略的創造研究推進事業ERATO「胡桃坂クロマチンアトラスプロジェクト（研究総括：胡桃坂仁志、JPMJER1901）」、同戦略的創造研究推進事業CREST「核内環境による生命力維持機構の解明（研究代表者：胡桃坂仁志、JPMJCR24T3）」、AMED創薬等先端技術支援基盤プラットフォーム（BINDS、JP25ama121009）、理研新領域開拓課題「TADからゲノム構築原理を読み解く（領域代表者：古関明彦）」、理研基礎科学特別研究員制度による助成を受けて行われました。

原論文情報

• Fukai Y. T., Kujirai T., Wakamori M., Kanamura S., Yamauchi L., Zeraati S., Morita S., Tanegashima C., Kadota M., Shirouzu M., Kurumizaka H., Umehara T., Kawaguchi K., "Gene-scale in vitro reconstitution reveals histone acetylation directly controls chromatin architecture", Science Advances, 10.1126/sciadv.adx9282

発表者

理化学研究所
生命機能科学研究センター
研究員（研究当時）深井 洋佑（フカイ・ヨウスケ）
（現 開拓研究所 川口生体非平衡物理学研究室 研究員）
理研白眉研究チームリーダー（研究当時）川口 喬吾（カワグチ・キョウゴ）
（現 開拓研究所 川口生体非平衡物理学研究室 主任研究員、東京大学 大学院理学系研究科 附属知の物理学研究センター 准教授）
エピジェネティクス制御研究チーム（研究当時）
技師（研究当時）若森 昌聡（ワカモリ・マサトシ）
チームリーダー（研究当時）梅原 崇史（ウメハラ・タカシ）
（現 立命館大学 薬学部 教授）

東京大学 定量生命科学研究所
先端定量生命科学研究部門 クロマチン構造機能研究分野
講師 鯨井 智也（クジライ・トモヤ）
教授 胡桃坂 仁志（クルミザカ・ヒトシ）

発表者のコメント

今後の応用を通して、細胞状態を読み解く技術の確立に貢献できることを楽しみにしています。これまでサポートいただいた全ての方と、研究遂行の助成予算を支出いただいた皆さまに感謝します。（深井 洋佑）

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